Tehnologija proizvodnje insulina

Analize

Inzulin je eden izmed hormonov, ki jih proizvaja človeško telo, predvsem trebušna slinavka. Kršitev izločanja te snovi povzroči nastanek tako hude bolezni, kot je diabetes. Za njeno zdravljenje z uporabo sintetičnega hormona, ki je dolgo časa izoliran iz trebušne slinavke živine. Vendar pa se tehnologija za proizvodnjo insulina s pomočjo zelo običajne bakterije - Escherichia coli ali glivice iz kvasa uporablja že dolgo časa. Z uporabo te metode se lahko izognete alergijskim reakcijam, ki jih povzročajo tuji proteini, ki imajo rahlo razliko od človeka.

Tehnološka shema

Tehnologija proizvodnje insulina vključuje vse glavne faze proizvodnje biotehnoloških izdelkov. Rezultat je kristalni končni produkt, ki ga nato uporabimo za pripravo injekcijskih raztopin, ki se uporabljajo pri zdravljenju hude sladkorne bolezni tipa I in II. Glavni učinek tega hormona v telesu se kaže v zmanjšanju ravni glukoze v krvi.

Faze proizvodnje insulina bodo naslednje: t

Predhodno. Opravlja postopke, kot so priprava in čiščenje vode in zraka, čiščenje industrijskih prostorov in sterilizacija opreme, pregled osebja, obdelava rok in izdajanje sterilnih čevljev in oblačil. Tudi na začetni stopnji se izvede primarna kemijska sinteza molekularnih verig, iz katerih je sestavljena beljakovina. Veriga A vsebuje 21 aminokislinskih ostankov in veriga B vsebuje 30 aminokislin.
Priprava hranilnih raztopin in celične kulture. Da bi živa celica proizvedla potrebno spojino, smo uvedli ustrezen gen. Za to se plazmid razreže s posebnimi encimi, restrikcijami in v njega so sešiti geni, ki kodirajo sintezo potrebnih spojin. Nato se z uporabo metode mikroinjekcije modificirani plazmid vrne v celico.
Gojenje celične suspenzije. Gensko spremenjene celice se vnesejo v hranilno raztopino, ki ima vse sestavine, potrebne za rast in razmnoževanje ter se sterilizira. Pridelava kulture poteka v posebnih bioreaktorjih, kjer se dovajamo predhodno prečiščeni zrak. Občasno se v reaktor doda določena količina hranilne raztopine in istočasno odvzame enak volumen celične suspenzije.
Dodelitev kulture. Ločevanje tekočine in celične kulture poteka s sedimentacijo (sedimentacijo) v posebnih sedimentatorjih in nato s filtracijo, ki omogoča ohranitev celovitosti celic.
Kromatografsko čiščenje snovi. T Izvaja se na ustrezni opremi z različnimi metodami, zlasti s frontalno, anionsko izmenjevalno in gelsko permeacijsko kromatografijo.
Pridobivanje proteinske molekule. Na dejanski biotehnološki stopnji pride do sinteze neproduktirane molekule insulina. In dve komponenti njenih verig. Po oksidaciji in prepogibanju pridobljenih verig se jih sešita, kar ima za posledico tvorbo disulfidnih mostov.
Liofilizacijo v posebni pečici, nato pa se preveri skladnost kristaliničnega pripravka s standardom, pakira, označi in odpremi potrošniku.

Naše podjetje pod ugodnimi pogoji ponuja konfekcijske proizvodne linije, kjer je v celoti izpolnjena vsa tehnologija proizvodnje insulina. Zaradi natančnih izračunov, tehnične in informacijske podpore ter usposabljanja osebja v okviru celovitega programa bo podjetje dobičkonosno, njegovi izdelki pa bodo v povpraševanju.

Odkritje insulina

Danes sladkorna bolezen prizadene več kot 400 milijonov ljudi na planetu, kar je približno 8% odrasle populacije na svetu. Po podatkih državnega registra v Rusiji več kot 3,3 milijona ljudi trpi za sladkorno boleznijo (okoli 300 tisoč ljudi trpi za sladkorno boleznijo tipa 1, približno 3 milijone pa za sladkorno bolezen tipa 2). Vendar te številke verjetno ne bodo odražale dejanskega stanja. Vsi ti ljudje, ki živijo vsak dan, razumejo, da je njihovo življenje odvisno od insulina.

Prvi poskusi za zdravljenje sladkorne bolezni so bili narejeni pred našo dobo. Za to masažo, gimnastiko, kopeli, aromaterapijo in še veliko več so se uporabljali stari grški in rimski zdravniki. V 19. stoletju je bila za diabetike razvita prehrana z nizko vsebnostjo ogljikovih hidratov. Prvi poskus zdravljenja sladkorne bolezni z injekcijami insulina je bil opravljen leta 1921. Kanadski znanstvenik Frederick Banting je postal prva oseba, ki je uporabljala insulinski hormon za nadzor diabetesa. Bil je le 32 kod, ko je prejel Nobelovo nagrado za medicino. Zdravilo je ustvaril učinkovito in brez stranskih učinkov zmanjšal raven glukoze z 28,9 na 6,7 mmol / l. To zdravilo je dalo življenje mnogim.

Leta 1869 je znanstvenik Paul Langergans odkril skupine celic v trebušni slinavki, ki so jih pozneje poimenovali "Langerhansovi otoki". Insulin je bil nato izoliran iz celic teh otočkov. Insulin je hormon, ki uravnava presnovo, predvsem ogljikovih hidratov (sladkorjev), pa tudi maščob in beljakovin. Pri sladkorni bolezni zaradi nezadostne izpostavljenosti insulinu pride do zapletene presnovne motnje, povišanja sladkorja v krvi (hiperglikemija), sladkorja se izloči z urinom (glikozurija), v telesu krvnega ketona (ketoacidoza) pa se pojavijo kisli izdelki z zmanjšanim izgorevanjem maščob.

Po odkritju insulina so mnogi znanstveniki začeli razvijati metode čiščenja te droge, ker imajo nečistoče škodljiv učinek na oslabljeno telo.

Agilent Technologies je vodilna v svetu na področju analitične opreme. Naprave za kromatografsko in spektralno analizo že več kot eno leto pomagajo znanstvenikom po svetu pri reševanju ključnih problemov farmacevtskih izdelkov. Nadzor čistosti insulina ni nobena izjema. Pred tem je bila za te namene uporabljena klasična tekočinska kromatografija, pri čemer so bili rezultati zelo sprejemljivi:

Po številnih raziskavah so znanstveniki dokazali, da je nastali insulinski polipeptid z molekulsko maso okoli 6000 učinkovito identificiran z uporabo najnovejših dosežkov na področju izključitvene kromatografije.

S to novo metodo lahko primerjamo »dober insulin«, ki je bil shranjen v priporočenih pogojih in »slab insulin«. Ko smo dva kromatograma prekrivala drug drugega, se je izkazalo, da je bila pri pripravku insulina, ki je bil shranjen pod neugodnimi pogoji, tarčna molekula uničena in namesto tega so bili na kromatogramu identificirani razpadni produkti.

Razvoj in poenotenje metod za analizo in standardizacijo insulinskih pripravkov z reverzno fazno visokotlačno tekočinsko kromatografijo (RP HPLC) Pikhtar Anatolij Vasiljevič

V diplomski nalogi je treba v bližnji prihodnosti obiskati knjižnico.
Obvestite o sprejemu

Teza - 480 rubljev., Dostava 10 minut, 24 ur na dan, sedem dni v tednu in prazniki.

Izvleček - 240 rubljev, dostava 1-3 ure, od 10-19 (moskovski čas), razen nedelje

Pihtar Anatolij Vasiljevič. Razvoj in poenotenje metod za analizo in standardizacijo pripravkov insulina z reverzno fazno visokotlačno tekočinsko kromatografijo (RP HPLC): disertacija. Kandidat za farmacevtske vede: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Vasiljevič; [Kraj varstva: Moskovska medicinska akademija].- Moskva, 2005.- 139 str.: Il.

Vsebina disertacije

POGLAVJE 1. Pregled literature 11

1. Vloga insulina pri zdravljenju sladkorne bolezni 11

2. Biosinteza in biološko delovanje insulina 12

3. Splošne značilnosti fizikalno-kemijskih in farmacevtskih lastnosti insulina 15

4. Pripravki insulina 24

5. Proizvodne metode, standardizacija in nadzor kakovosti pripravkov insulina 31

6. Uporaba HPLC pri farmacevtski analizi insulina. 46

POGLAVJE 2. Izjava o težavi 50

POGLAVJE 3. Študija vpliva različnih dejavnikov na kromatografsko obnašanje insulina v pogojih RP HPLC 56

1. Metode in materiali 57

2. Razprava o rezultatih 62

2.1. Vpliv sestave puferske raztopine 62

2.2. Učinek koncentracije natrijevega sulfata 68

2.3. Vpliv temperature kromatografske kolone 70

2.4. Učinek organskega modifikatorja 75

2.5. Vpliv dolžine alkilnega radikala cepljene faze 80

2.6. Vpliv dolžine kromatografske kolone 80

POGLAVJE 4. Izboljšanje farmakopejskih metod za analizo pripravkov insulina, ki temeljijo na uporabi RP HPLC 82

1. Izbira optimalnih pogojev za kromatografsko določanje insulina in njegovih nečistoč v zdravilnih pripravkih 82

2. Metrološke značilnosti metode 84

3. Uporaba razvite metodologije za testiranje uradnih insulinskih pripravkov 95

POGLAVJE 5. Razvoj metod za analizo injekcijskih doznih oblik izofan-insulina na podlagi metode PF HPLC 107 t

1. Izbira pogojev za kromatografsko določanje protamina v dozirnih oblikah izofan-insulina 110

2. Študija kromatografskih profilov protaminov, izoliranih iz različnih vrst rib 121

3. Metoda za določanje protamina v pripravkih izofan-insulina 123

4. Validacija razvite metodologije 125

Splošni sklepi 136

Literatura 139

Splošne značilnosti fizikalno-kemijskih in farmacevtskih lastnosti insulina

S kemičnega vidika je insulin majhen kroglasti protein z molekulsko maso do 6000 Da. Hkrati je treba opozoriti, da je insulin splošno ime za celo družino homolognih beljakovin naravnega in umetnega izvora s skupno značilno biološko aktivnostjo. Proteinska narava insulina je bila ustanovljena leta 1928 [52]. To je med beljakovinami, ki proizvajajo biuretno reakcijo in Paulijevo reakcijo. Struktura insulina je bila v celoti vzpostavljena v zgodnjih 50. letih. Za elementarno kemično sestavo insulinov različnega izvora so značilne številke, navedene v tabeli 1 [40].

Sestava aminokislin. Vecina molekul insulina vsebuje 51 aminokislinskih ostankov, med katerimi je 17 aminokislin, najdenih v vecini znanih proteinov.

Značilna značilnost aminokislinske sestave govejega, prašičjega in humanega insulina je triptofan in metionin. Sestava aminokislin teh vrst insulina je predstavljena v tabeli 2 [40,46].

Vsebnost cistina (6 pol cistinskih ostankov) je nespremenljiva za vse vrste insulina. Poleg tega molekula insulina vseh vrst vsebuje 6 amidnih skupin (asparagin, glutamin).

Ko se insulin spusti, skupaj z glavno frakcijo, lahko opazimo frakcije deamidiranih oblik insulina. V kislem okolju se lahko v procesu deamidacije postopoma odcepi vseh 6 amidnih skupin in elektroforetska in kromatografska mobilnost sprememb insulina [40]. Nastajanje deamidiranih oblik insulina se lahko oceni na podlagi rezultatov določanja amoniaka. Za popolnoma amidno obliko insulina se določi 6 mol amoniaka na 1 mol beljakovin, pri deamidiranih oblikah pa je ta vrednost od 5 do 0.

Primarna struktura insulina. Primarno strukturo insulina je skupina Sanger dešifrirala leta 1945-1955. Z uporabo številnih kromatografskih metod, ki so omogočile ločevanje in identifikacijo različnih peptidov, aminokislin in njihovih derivatov, je Sanger uspel vzpostaviti primarno strukturo govejega insulina [130,131,132,133,134,135]. Nadaljnje študije insulinov različnega izvora z različnimi fizikalno-kemijskimi metodami, vključno z Edmanovo metodo za določanje polnega zaporedja aminokislin v dolgih peptidih, so potrdile ugotovitve Sangerja in njegovih soavtorjev o strukturi insulina [bb].

Do danes je bila primarna struktura insulina določena pri predstavnikih 24 vrst, ki spadajo v 4 razrede živali: sesalcev, ptic, rib in ciklostom [14]. Raziskave o insulinu različnega izvora se nadaljujejo [71,72,73].

Struktura insulina pri različnih živalih je podobna, vendar ne enaka. V svoji primarni strukturi je humani insulin podoben prašičjim psom, psom, kitolovom in kunčjim insulinom, ki se razlikujejo le v eni aminokislini [40]. Od goveda se razlikuje od treh aminokislin. V večji meri človeški insulin ni podoben insulinu gvinejskega prašiča, ptic in rib [40]. Razlike v aminokislinskem zaporedju humanih, prašičjih in govejih insulinov so prikazane v tabeli 3.

Kljub strukturnim razlikam imajo vse vrste insulinov podobno biološko aktivnost, t.j. povzročajo hipoglikemični učinek. Vendar je obseg prikazane biološke aktivnosti močno odvisen od vrste in je v razponu od 11 ie / mg (inzulin iz Severnega morja) do 62 ie / mg (puran in piščančev insulin), medtem ko je aktivnost humanega insulina približno 25-30 ie / mg [40]. Večja kot so razlike med vrstami, večja je razlika v biološki aktivnosti ustreznega insulina.

Funkcionalno aktivna molekula insulina je sestavljena iz dveh polipeptidnih verig (A in B verige), ki sta povezani z disulfidnimi vezmi; eno vez tvorijo sedmi aminokislinski ostanki obeh verig, druga disulfidna vez tvorijo 20. ostanek A-verige in 19. ostanek B-verige (slika 2). Poleg tega je v molekuli insulina tretja disulfidna vez, ki je intrachain in povezuje 6. in 11. ostanke A-verige [59,117].

Sekundarna struktura Z uporabo različnih fizikalno-kemijskih in fizikalnih raziskovalnih metod je bilo dokazano, da ima molekula insulina visoko urejeno prostorsko strukturo (konformacijo), kar prispeva k uresničevanju specifičnih bioloških funkcij [14]. V molekuli nativnega insulina sta hkrati prisotni cc-helix in p-fold listi. Poleg tega obstajajo območja z neurejeno strukturo in strukturo <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Ko se kisla raztopina insulina (pH 2,3-2,5) segreje pri temperaturi +100 ° C in hitro ohladi na -80 ° C, nastane tako imenovani fibrilarni insulin - popolnoma neaktivna oblika hormona [27]. Vnos fibrilarnih vlaken insulina v raztopino aktivnega insulina povzroči spontano kvantitativno obarjanje inzulina v obliki fibrilov [14,17].

Metode proizvodnje, standardizacija in nadzor kakovosti pripravkov insulina

Pridobivanje živalskih vrst insulina. Industrijska proizvodnja govejega in svinjskega insulina je bila ustanovljena skoraj istočasno v številnih državah kmalu po odkritju insulina leta 1921 [63]. Od takrat je koncept pridobivanja insulina ostal skoraj nespremenjen (tabela b) [17, 18]. Surovine za proizvodnjo živalskih vrst insulina so trebušna slinavka klavnega goveda, ki se uporablja za prehrano.

Najpomembnejša naloga pri proizvodnji insulina je njeno čiščenje - sproščanje snovi iz sorodnih nečistoč, ki zmanjšujejo biološko aktivnost, povzročajo imunološke reakcije ali so potencialno nevarne za zdravje bolnika. Na primer, po nekaj letih uporabe slabo prečiščenega insulina v krvi pacienta lahko obstaja do 5.000 ie insulina, vezanega na protitelesa. Protitelesa proti insulinu pomembno vplivajo na profil njegovega delovanja in s tem prispevajo k labilnemu poteku sladkorne bolezni.

Prva metoda čiščenja insulina je bila rekristalizirana v prisotnosti cinkovih soli. Leta 1945 je bilo dokazano, da sedemkratna prekristalizacija insulina bistveno zmanjša raven alergijskih reakcij pri bolnikih v primerjavi z uradnimi insulini v tistem času [63].

Heterogenost vzorcev insulina po kristalizaciji in enkratni prekristalizaciji je prikazana z različnimi metodami: protitočna ekstrakcija (PE), distribucijska kromatografija (PX), ionska izmenjalna kromatografija (IOC), diskelektroforeza (DEP) in gelska izključitvena kromatografija (GEC) [63]..

Ugotovljeno je bilo, da so glavne spremljajoče nečistote insulina: proinzulin, njegovi intermediati, kovalentni dimer insulina, mono-disamido inzulin, monoarginin in mono-etilen, kot tudi številne visokomolekularne spojine, ki niso insulinske narave. Splošni zaključek rezultatov študij, ki so upoštevali informacije o imunološki aktivnosti zaznanih nečistoč [138], je bil zaključek o potrebi po dodatnem čiščenju insulinskih snovi, tako da je pri analizi z metodami DEF in GEC ugotovljena ena komponenta - ustrezni insulin.

Za rešitev problema čiščenja insulina leta 1950 je bila predlagana metoda HEC, leta 1970 pa metoda anionske izmenjevalne kromatografije (AOX). Ugotovljeno je bilo, da insulin, prečiščen z metodo AOX, vsebuje približno 500 ppm (delov na milijon) nečistoč s proinzulinsko aktivnostjo [137]. Dodatno čiščenje inzulina z uporabo visokotlačne tekočinske kromatografije na obrnjenih fazah (RP HPLC) zmanjša vsebnost imunogenih frakcij na mejo njihove detekcije [63].

Pregled trenutnega razvoja na področju kromatografskega čiščenja insulina je predstavljen v [96]. Insulin, prečiščen zaporedoma z uporabo IOC in GEC, se imenuje monokomponentni insulin [63]. Pridobivanje humanega insulina. Iskanje metod za pridobivanje humanega insulina je bilo posledica dveh okoliščin. Po eni strani je nujnost problema surovine v primeru proizvodnje živalskega insulina po drugi strani hiter razvoj znanosti na tem področju zagotovila resnično priložnost za uresničitev ideje. Leta 1979 in 1981 skoraj sočasno sta bili razviti dve metodi pridobivanja humanega insulina - biosintetični in polsintetični [102,108]. Leta 1981 je podjetje Novo Nordisk prvič na svetu začelo serijsko proizvodnjo humanega polsintetičnega insulina. Metoda, ki jo je uporabila družba, temelji na encimski in kemijski zamenjavi Al v molekuli prašičjega inzulina z ostankom Tre [61]. Ta metoda je neposredno odvisna od pridobivanja potrebne količine svinjskega insulina, kar zmanjšuje njegovo ekonomsko vrednost. Možnost pridobivanja humanega insulina z biosintetično metodo se je pojavila z razvojem tehnologije rekombinantne DNA [10]. Dela o proizvodnji gensko spremenjenega insulina so se začela pred približno 25 leti. Leta 1978 so poročali, da je bil dobljen sev proinsou-ling za podgano produkcijo E. coli. Leta 1979 so Genentechove študije uspele klonirati v E. coli gene, ki kodirajo aminokislinske sekvence za. inzulinske verige A in B, vključene v p-halo-tacidazno regijo plazmida pBR322 [10,102]. Leta 1981 je bil sintetiziran proinzulinski gen-analog mini-C-proinzulina, v katerem je bil 35-členski C-peptid nadomeščen s segmentom šestih aminokislin: arg-arg-gly-ser-lys-arg in njegova ekspresija v E. coli. Leta 1982 je Eli Lilly začel s prvo industrijsko proizvodnjo človeškega insulina na svetu z uporabo dveh verižnih tehnologij, razvitih v sodelovanju z Genentechom [102]. Trenutno je bila prikazana možnost pridobivanja humanega insulina s pomočjo različnih ekspresijskih sistemov [3,10,101,102]. Z gospodarskega vidika je zlasti zanimiva uporaba gensko spremenjenih sevov gram-pozitivnih bakterij E.coli, od katerih se mnogi obravnavajo kot prekomerni pridelovalci [3]. Istočasno je bil pomemben napredek dosežen s celicami kvasovk Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabela 7 navaja glavne, skupne za različne metode proizvodnje rekombinantnega humanega insulina, faze tehnološkega procesa [3,10,63].

Uporaba razvite metodologije za testiranje uradnih insulinskih pripravkov

Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC) je različica tekočinske kromatografije, pri kateri mobilna faza - eluent - prehaja skozi sorbent, ki napolni kolono pri visoki hitrosti zaradi velikega pritiska (do 400x105 Pa) na vhodu v kolono [11].

Za analizo kompleksnih zmesi snovi se je HPLC pojavil pred nekaj več kot 30 leti. Uporaba sorbentov s premerom delcev 3–10 μm je povzročila močno povečanje učinkovitosti kromatografskega ločevanja v primerjavi s klasično različico kolonske tekočinske kromatografije. Zato se HPLC pogosto imenuje tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC). Instrumentalne značilnosti uporabe HPLC so podrobno opisane v številnih priročnikih [49,50] in v ustreznih oddelkih vodilne farmakopeje [79,150]. Za HPLC je bil razvit širok spekter sorbentov in se proizvaja. Po mnenju avtorjev raziskave [51] - okoli 100 podjetij po svetu proizvede več kot 300 vrst sorbentnih imen. Zgodovina, trenutno stanje in perspektive razvoja metode so obravnavane v pregledih [51] in [77.78].

Pri različnih variantah se metoda HPLC široko uporablja v farmacevtski analizi (kontrola proizvodnje in testiranje kakovosti zdravil). Metoda je vključena v vse vodilne farmakopeje na svetu. Ta metoda je najbolj opisana v evropski in ameriški farmakopeji. HPLC se uporablja za identifikacijo zdravil, za določitev čistosti, frakcijsko sestavo molekulske mase in kvantitativno analizo. V US Pharmacopoeia 28 ed. približno 30% zasebnih izdelkov vključuje uporabo HPLC. V Evropski farmakopeji 4. izd. ta številka je približno 40%.

Prva kromatografska metoda za testiranje insulina je bila nizkotlačna gelska izključitvena tekočinska kromatografija (GE ZhND). Načelo ločevanja pod pogoji HPLC temelji na različni sposobnosti molekul različnih velikosti, da prodrejo v pore nevtralnega gela, ki služi kot stacionarna faza. Hidrodinamični premer insulinskega monomera in dimera je sorazmeren z njihovo molekulsko maso in znaša 2,69 oziroma 5,50 nm [115].

Leta 1967 je bilo po metodi GE-IHDD pokazano, da komercialni pripravki insulina, prečiščeni s kristalizacijo, vsebujejo nečistoče z molekulsko maso, ki presega molekulsko maso insulina [63]. Na kromatogramu prašičjega inzulina so našli tri vrhove, ki so običajno označeni kot a-, b- in c-komponente. Od takrat je bilo predlaganih več kromatografskih sistemov za nadzor vsebnosti nečistoč z visoko molekulsko maso v insulinih. Ločitev smo izvedli na visoko nabrekajočih agaroznih kserogelih (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Ali dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M raztopine ocetne kisline uporabili kot IF [127]. Zaradi visoke občutljivosti teh sorbentov na stiskanje pri tlakih, ki presegajo tlak nabrekanja matrice, so ti materiali neprimerni za delovanje v načinu HPLC.

Uporaba gel-izključitvene tekočinske kromatografije pri visokih tlakih (GE HPLC) za analizo insulina je bila prvič opisana leta 1980, po razvoju trdih makroporoznih sorbentov, združljivih z vodo, in odpornih na visoke pritiske. V [151] je bila ločitev izvedena na kolonah Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) v pogojih denaturacije (kombinacija 7 M raztopine sečnine, mineralnih kislin in neionskih snovi) detergenti). Potreba po analizi insulina v denaturacijskih pogojih je povezana s sposobnostjo inzulina, da se agregira v raztopini. Za ločevanje insulina v pogojih HPLC HPLC je bila opisana tudi uporaba "tradicionalne" eluentne ocetne kisline [152]. Uporaba ocetne kisline ima več prednosti - minimalen vpliv na nativno strukturo ločenih spojin, razpoložljivost, nizki stroški, poleg tega je pomembno dejstvo, da ocetna kislina zavira povezavo insulina.

Trenutno je HPLC ghvd farmakopejska metoda za spremljanje vsebnosti nečistoč z visoko molekulsko maso v snoveh in končnih oblikah. Metoda se uporablja tudi za določanje vsebnosti protamina v preparatih izofanskega insulina.

Uporaba HPLC na reverznih fazah (RP HPLC) za ločevanje goveda in prašičjega inzulina je prvič pokazala visoko učinkovitost te metode za analizo insulinu podobnih peptidov s podobno strukturo.

Mehanizem ločevanja proteinov in polipeptidov v pogojih RP HPLC temelji na različni hidrofobnosti molekul insulina in sorodnih nečistoč. Doslej je bilo opisanih več deset metod za kromatografsko ločevanje insulina različnega izvora in njihovih derivatov, vključno s proin-sulinom, pankreatičnimi polipeptidi, dezamido derivati, insulinski dimer. [126] je pokazala možnost ločevanja piščančjega, kunčjega, ovčjega in konjskega insulina. Ločili smo tudi človeški, goveji in svinjski insulin. Lloyd in Corran sta objavila metodo za ločevanje govedine, svinjine, človeških insulinov in njihovih ustreznih deamidiranih oblik [104].

Ločevanje poteka na silikagelnih sorbentih z modificiranimi, metilnimi, butilnimi, oktilnimi, oktadecilnimi in fenilnimi skupinami v izokratskem ali gradientnem načinu. Kot PF se uporabljajo organski modifikatorji - acetonitril, metilni alkohol, izopropilni alkohol, pomešani z vodnimi pufernimi raztopinami, ki vsebujejo anorganske soli in ionske parne reagente. Detekcija vrha se izvaja predvsem s spektrofotometrično metodo pri valovni dolžini 190-220 nm, opisane so tudi fluorimetrične metode [103].

Analiza snovi in končnih doznih oblik insulina z uporabo RP HPLC je opisana v zasebnih člankih v ameriški in evropski farmakopeji [79,150]. Metoda se uporablja za testiranje zdravil določene skupine v smislu "pristnosti insulina", "sorodnih beljakovin", "kvantitativne določitve" in "raztopine insulina".

Raziskovalna literatura opisuje tudi uporabo ionske izmenjave in afinitetne kromatografije za analizo insulina [44,102], vendar te metode v farmakopejski praksi niso široko uporabljene.

Izbira pogojev za kromatografsko določanje protamina v dozirnih oblikah izofan-insulina

Povečanje ionske jakosti PF običajno vodi do povečanja razmerij kapacitete insulina, kar lahko povzroči več dejavnikov: - povečanje koncentracije ionov zmanjša stopnjo ionizacije nabitih skupin proteinske molekule, povečanje njene hidrofobnosti / - visoka koncentracija kationov prispeva k presejanju prostih silanolnih skupin na stacionarni površini. faza, ki oslabi nespecifično elektrostatično interakcijo protoniranih amino skupin proteina z matriksom; - visoka ionska moč vpliva na prostorsko strukturo insulina, zaradi česar se spremeni površina, ki je v interakciji s sorbentom. Koncentracija anorganskih soli v FS vpliva na obliko vrhov in selektivnost ločevanja insulina in desamido-Asn-insulina [143,144]. Z izokratskim eluiranjem na sorbentu LiChrosorb Sív z 0,1 M raztopino natrijevega fosfata (pH 2,3) je bil dosežen zadovoljiv rezultat le, ko je bil pufrski raztopini dodan natrijev sulfat do koncentracije 0,1 M. Večina metod za analizo insulina, vključenih v farmakopejske izdelke in ND PF uporabimo na osnovi pufernih raztopin z vsebnostjo natrijevega sulfata 0,2 M. Takšna visoka vsebnost natrijevega sulfata negativno vpliva na ponovljivost rezultatov kromatografije zaradi stratifikacije eluentov, poleg tega pa visoko koncentrirane raztopine soli negativno vplivajo na kromatografsko opremo in skrajšajo njeno življenjsko dobo. Glede na to, da so bile farmakopejske metode analize razvite pred več kot 20 leti, je bilo zanimivo preučiti kromatografsko obnašanje insulina pod OF-HPLC na kromatografskih sorbentih zadnje generacije, odvisno od koncentracije natrijevega sulfata. Hkrati so skušali ugotoviti, ali je zmanjšanje vsebnosti natrijevega sulfata v PF dovoljeno brez znatnega poslabšanja sposobnosti ločevanja kromatografskega sistema. Kot rezultat raziskave je bilo ugotovljeno, da je učinek koncentracije natrijevega sulfata v PF različen, odvisno od vrste cepljene faze, pa tudi od vrste insulina. Na sorbentih s cepljenimi skupinami C4 in C selektivnost ločevanja vrhov humanega insulina in desamido-Asn humanega insulina ni odvisna od koncentracije natrijevega sulfata v. raztopina puferja 1 v območju od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbentu Diaspher-110-C18 ima ločilna selektivnost tega para vrhov največje vrednosti pri 0,05 M in najmanj pri 0,1 M (diagram 4). Po drugi strani pa selektivnost ločevanja živalskih vrst inzulina in njihovih ustreznih desamidiranih oblik AsnA21 ni odvisna od ionske jakosti raztopine, ko je ločena na sorbentu Diasphere-110-C18. Na sorbentu s C8 cepljenimi skupinami se selektivnost poveča z 1,25 na 1,28 s povečanjem koncentracije natrijevega sulfata (slika 4). Na sorbentu s C4 cepljenimi skupinami je selektivnost ločevanja v primeru govejega insulina največja pri 0,1 M natrijevega sulfata in minimalna na 0,2 M. Za svinjski insulin ni izrazitega maksimuma pri koncentraciji natrijevega sulfata 0,1 M, v tem primeru povečanje ionskega sile so povzročile zmanjšanje selektivnosti ločevanja (slika 4). Število učinkovitih teoretičnih plošč se povečuje s povečanjem koncentracije natrijevega sulfata. Izjema je obnašanje humanega insulina na sorbentu Diasfer-110-C8 (slika 5). Stopnja ločenosti vrhov insulina in desamido-Asn-inzulina narašča s povečanjem ionske jakosti FS, ne glede na vrsto insulina in vrsto cepljene faze (diagram b). Z zmanjšanjem koncentracije natrijevega sulfata z 0,2 M na 0,1 M se stopnja ločitve izbranega para vrhov v povprečju zmanjša za 5% za humane in prašičje insuline in za 10% za goveji insulin. Ob upoštevanju dejstva, da absolutna vrednost stopnje ločenosti presega 2,0, merjeno poslabšanje ločilne zmogljivosti kolone po našem mnenju ni pomembno. Posledično lahko koncentracijo natrijevega sulfata v pufrski raztopini PF zmanjšamo 2-krat v primerjavi s farmakopejskimi metodami analize.

V večini študij o analizi proteinov in peptidov se ločevanje izvaja pri sobni temperaturi. Poleg tega nekateri avtorji kažejo, da je učinek temperature na selektivnost ločevanja minimalen [48]. Z naraščanjem temperature pa se pospeši proces masovne izmenjave med stacionarnimi in mobilnimi fazami, kar vodi do zmanjšanja retencijskega časa peptidov in zmanjšanja vrhov.

Tehnologija insulina

Kršitev izločanja insulina. Uporaba affiliate fotografije. Shema za insulin. Ekspresija proinzulina v celicah E. coli. Pristopi k reševanju problema sladkorne bolezni. Prispevek biotehnologije k industrijski proizvodnji nepeptidnih hormonov.

Pošljite svoje dobro delo v bazo znanja preprosto. Uporabite spodnji obrazec.

Študenti, podiplomski študenti, mladi znanstveniki, ki uporabljajo znanje v svojem študiju in delu, vam bodo zelo hvaležni.

Objavljeno dne http://www.allbest.ru/

MINISTRSTVO ZA IZOBRAŽEVANJE IN ZNANOST REPUBLIKE KAZAHSTAN

KAZAHKO AGRO-TEHNIČNA UNIVERZA NAME NA PODROČJU S.SEYFULLIN

Oddelek za mikrobiologijo in biotehnologijo

O disciplini "Biotehnologija mokroorganizmov"

Na temo: tehnologija za insulin

Dokončano: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Preverjeno: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

KRATICE IN SIMBOLI

1. Zgodovina odkrivanja

2. Pridobivanje insulina v biotehnologiji

3. Načine za pridobivanje humanega insulina

4. Ekspresija proinzulina v celicah E. coli

5. Čiščenje insulina

6. Odmerjanje in uporaba

V tem predmetnem delu smo uporabili naslednje definicije:

Proteinski nosilec - zagotavljanje transporta hibridnega proteina v periplazmičnem prostoru celice ali gojišča;

Afinitetna komponenta - znatno olajša izbiro hibridnega proteina.

Insulin (iz latinščine. Insula - otok) - peptidni hormon, nastane v beta celicah Langerhansovih pankreasnih otočkov.

Interlevkini so skupina citokinov, ki jih sintetizirajo predvsem levkociti (zato je bil izbran konec "-leukina").

Proinzulin je prekurzor insulina, ki ga sintetizirajo celice B insularnega aparata trebušne slinavke.

Kromatografija (iz grščine Chroma, kromatos - barva, barva), fizikalno-kemijska metoda ločevanja in analize zmesi, ki temelji na porazdelitvi njihovih komponent med obema fazama - stacionarnim in premičnim (eluent), ki teče skozi stacionarno.

Encapsulation - mehanizem programskega jezika, ki omejuje dostop do komponent, ki sestavljajo objekt (metode in lastnosti), jih naredi zasebne, to je dostopne samo znotraj predmeta.

Fuzijski protein (fuzijski protein, tudi kimerni spojinski protein) je protein, pridobljen z združevanjem dveh ali več genov, ki so prvotno kodirali ločene proteine.

Hormoni (od grščine. Hormao - sprožijo, inducirajo), hormone, biološko aktivne snovi, ki jih proizvajajo endokrine žleze ali endokrine žleze, in jih izločajo neposredno v kri.

Diabetes mellitus je skupina endokrinih bolezni, ki se razvija kot posledica absolutne ali relativne pomanjkljivosti hormonskega insulina.

Encapsulation - mehanizem programskega jezika, ki omejuje dostop do komponent, ki sestavljajo objekt (metode in lastnosti), jih naredi zasebne, to je dostopne samo znotraj predmeta.

Somatostatin je hormon delta celic Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in eden od hormonov hipotalamusa.

Radioimunska analiza je metoda za kvantitativno določanje biološko aktivnih snovi (hormonov, encimov, zdravil itd.) V bioloških tekočinah, ki temelji na kompetitivni vezavi želenih stabilnih in podobnih z radionuklidom označenih snovi s specifičnimi veznimi sistemi.

KRATICE IN SIMBOLI

HPLC - tekočinska kromatografija visoke učinkovitosti

cDNA - komplementarna deoksiribonukleinska kislina

Glavna funkcija insulina je zagotoviti prepustnost celičnih membran za molekule glukoze. V poenostavljeni obliki lahko rečemo, da se ne le ogljikovi hidrati, ampak tudi vsa hranila, razdelijo na glukozo, ki se uporablja za sintezo drugih molekul, ki vsebujejo ogljik, in je edina vrsta goriva za celične elektrarne - mitohondrije. Brez insulina prepustnost celične membrane do glukoze pade 20-krat, celice pa umrejo od stradanja, presežek sladkorja pa se raztopi v krvi.

Oslabitev izločanja insulina zaradi uničenja beta celic - absolutno pomanjkanje insulina - je ključni element pri patogenezi diabetesa mellitusa tipa 1. t Kršitev učinka insulina na tkivo - relativno pomanjkanje insulina - ima pomembno mesto pri razvoju sladkorne bolezni tipa 2. t

Uporaba afinitetne kromatografije je bistveno zmanjšala vsebnost kontaminiranih beljakovin v pripravku z višjo molekulsko maso kot insulin. Takšni proteini vključujejo proinzulin in delno razcepljene proinsuline, ki so sposobni inducirati produkcijo antiinsulinskih protiteles.

Uporaba človeškega insulina od samega začetka zdravljenja zmanjša pojav alergijskih reakcij. Človeški insulin se hitreje absorbira in ima, ne glede na obliko zdravila, krajši čas delovanja kot živalski insulin. Človeški insulini so manj imunogeni kot svinjina, zlasti mešani goveji in prašičji insulini.

Namen tega predmeta je študij tehnologije inzulina. Za doseganje naslednjih ciljev so bili določeni:

1. pridobivanje insulina v biotehnologiji

2. Kako dobiti insulin

H. Čiščenje insulina

Zgodovina odkrivanja insulina je povezana z imenom ruskega zdravnika I.M. Sobolev (druga polovica 19. stoletja), ki je dokazal, da raven sladkorja v človeški krvi ureja poseben hormon trebušne slinavke.

Leta 1922 je desetletni deček prvič predstavil insulin, izoliran iz trebušne slinavke živali, bolnik s sladkorno boleznijo je presegel vsa pričakovanja in leto kasneje je ameriško podjetje Eli Lilly izdalo prvi živalski pripravek.

Po prejemu prve industrijske serije inzulina v naslednjih nekaj letih je bil prečrtan velik način njegove izolacije in čiščenja. Posledično je hormon postal na voljo bolnikom s sladkorno boleznijo tipa 1.

Leta 1935 je danski raziskovalec Hagedorn optimiziral delovanje insulina v telesu s predlogom za podaljšano zdravljenje.

Prvi insulinski kristali so bili pridobljeni leta 1952, leta 1954 pa je angleški biokemik G. Senger dešifriral strukturo insulina. Razvoj metod za čiščenje hormona iz drugih hormonskih snovi in produktov razgradnje insulina je omogočil pridobitev homogenega insulina, imenovanega enokomponentni insulin.

V zgodnjih 70. letih. Sovjetski znanstveniki A. Yudaev in S. Shvachkin predlagala kemično sintezo insulina, vendar je izvajanje te sinteze na industrijski ravni je bilo drago in nedonosnih.

V prihodnosti se je postopno izboljšala stopnja čiščenja insulinov, kar je zmanjšalo težave, ki jih povzročajo alergije na insulin, okvarjeno delovanje ledvic, okvaro vida in odpornost na imunski insulin. Najučinkovitejši hormon je bil potreben za nadomestno zdravljenje pri sladkorni bolezni - homologni insulin, tj. Humani insulin.

V osemdesetih letih je napredek v molekularni biologiji omogočil sintezo obeh verig humanega insulina z uporabo E.coli, ki sta bili nato združeni v biološko aktivno hormonsko molekulo, rekombinantni insulin pa je bil pridobljen z gensko spremenjenimi sevi E.coli na Inštitutu za bioorgansko kemijo.

2. Pridobivanje insulina v biotehnologiji

Insulin, peptidni hormon Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, je glavno zdravilo za sladkorno bolezen. To bolezen povzroča pomanjkanje insulina in se kaže v zvišanju ravni glukoze v krvi. Do nedavnega je bil insulin pridobljen iz trebušne slinavke bika in prašiča. Zdravilo se je od humanih insulinskih substitucij razlikovalo 1-3 aminokislinske zamenjave, tako da je obstajala nevarnost alergijskih reakcij, zlasti pri otrocih. Velika terapevtska uporaba insulina je bila omejena z visokimi stroški in omejenimi viri. S kemično modifikacijo se je insulin iz živali razlikoval od človeka, vendar je to pomenilo dodatno povečanje stroškov izdelka. [1]

Od leta 1982 Eli Lilly proizvaja gensko spremenjen insulin, ki temelji na ločeni sintezi E. colie - in B-verig. Strošek izdelka se je znatno zmanjšal, proizvedeni insulin je enak človeku. Od leta 1980 so v tisku poročali o kloniranju gena proinzulina, predhodnika hormona, ki prehaja v zrelo obliko z omejeno proteolizo.

Tehnologija inkapsulacije je povezana tudi z zdravljenjem diabetesa: celice trebušne slinavke v kapsuli, ki se enkrat vnesejo v pacientovo telo, proizvajajo insulin v enem letu.

Integrirana genetika je sprožila proizvodnjo hormonov, ki stimulirajo folikle in luteinizirajo. Ti peptidi so sestavljeni iz dveh podenot. Na dnevnem redu je vprašanje industrijske sinteze oligopeptidnih hormonov živčnega sistema, ankefalinov, zgrajenih iz 5 aminokislinskih ostankov, in endorfinov, analogov morfina. Z racionalno uporabo teh peptidov lajšanje bolečin, ustvarjanje dobre volje, povečanje učinkovitosti, osredotočenje pozornosti, izboljšanje spomina, ureditev spanja in budnosti. Primer uspešne uporabe metod genskega inženiringa je sinteza β-endorfina z uporabo hibridne proteinske tehnologije, opisane zgoraj za drug peptidni hormon, somatostatin [2].

3. Načine za pridobivanje humanega insulina

Zgodovinsko gledano je prvi način pridobivanja insulina za terapevtske namene izolacija analogov tega hormona iz naravnih virov (pankreasnih otočkov goveda in prašičev). V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je bilo ugotovljeno, da goveji in prašičji insulini (ki so po strukturi najbližji človeškemu insulinu in zaporedju aminokislin) kažejo aktivnost v človeškem telesu, ki je primerljiva s humanim insulinom. Po tem so za zdravljenje bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 1 dolgo uporabljali goveji ali prašičji insulin. Po nekaj časa pa se je pokazalo, da se v nekaterih primerih protitelesa proti govejim in prašičjim insulinom začnejo kopičiti v človeškem telesu in s tem izničijo njihove učinke.

Po drugi strani pa je ena od prednosti te metode pridobivanja insulina razpoložljivost surovin (goveji in prašičji insulin se lahko zlahka dobi v velikih količinah), kar je imelo odločilno vlogo pri razvoju prve metode pridobivanja humanega insulina. Ta metoda se imenuje polsintetična [3].

Pri tej metodi proizvodnje humanega insulina je bil prašičji insulin uporabljen kot surovina. Očiščeni prašičji inzulin smo cepili s C-terminalnim oktapeptidom B-verige, po katerem smo sintetizirali C-terminalni oktapeptid humanega insulina. Nato je bila kemično vezana, odstranjene so bile zaščitne skupine in dobljeni insulin je bil očiščen. Pri testiranju te metode pridobivanja insulina je bila prikazana popolna identiteta hormona, dobljenega za humani insulin. Glavna pomanjkljivost te metode je visoka cena nastalega insulina (tudi sedaj je kemijska sinteza oktapeptida draga, zlasti v industrijskem merilu).

Trenutno se humani insulin večinoma dobiva na dva načina: s spreminjanjem svinjskega insulina s sintetično-encimsko metodo in z metodo genskega inženiringa.

V prvem primeru metoda temelji na dejstvu, da se prašičji insulin razlikuje od humanega insulina z eno samo zamenjavo na C-koncu B-verige Ala30Thr. Nadomestitev alanina s treoninom izvedemo z encimsko katalizirano cepitvijo alanina in namesto tega pritrdimo karbonil-zaščiten treoninski ostanek, ki je prisoten v reakcijski zmesi v velikem presežku. Po cepitvi zaščitne O-terc-butilne skupine dobimo humani insulin. (slika 1)

Slika 1 - Shema metod za proizvodnjo humanega insulina

Insulin je bil prvi protein, pridobljen za komercialne namene z uporabo tehnologije rekombinantne DNA. Obstajata dva glavna pristopa za pridobivanje gensko spremenjenega humanega insulina. V prvem primeru ločeni (različni sevi proizvajalcev) proizvajajo obe verigi, ki ji sledi zlaganje molekule (tvorba disulfidnih mostov) in ločitev misoforma. V drugem pripravku v obliki prekurzorja (proinzulina), ki mu sledi encimsko cepitev s tripsinom in karboksipeptidazo. V aktivni obliki hormona. Trenutno je najprimernejša proizvodnja insulina kot predhodnika, ki zagotavlja pravilno zapiranje disulfidnih mostov (v primeru ločene proizvodnje verig, zaporednih ciklov denaturacije, ločevanja misoforma in renaturacije [3]).

V obeh pristopih je mogoče tako posamično pridobiti izhodne komponente (A in B verige ali proinzulin) in kot del hibridnih proteinov. Poleg A- in B-verig ali proinzulina je lahko prisotna tudi v sestavi hibridnih proteinov:

1) nosilni protein - zagotavljanje transporta hibridnega proteina v periplazmični prostor celice ali gojišča;

2) afinitetna komponenta - znatno olajša izbiro hibridnega proteina.

Hkrati sta lahko obe komponenti sočasno prisotni v sestavi hibridnega proteina. Poleg tega lahko pri ustvarjanju hibridnih proteinov uporabimo načelo multidimenzionalnosti (to je, da je v hibridnem proteinu prisotnih več kopij ciljnega polipeptida), kar omogoča bistveno povečanje donosa ciljnega produkta [4].

Uporabili smo sev JM 109 N1864 z nukleotidno sekvenco, vstavljeno v plazmid, ki izraža hibridni protein, ki je sestavljen iz linearnega proinzulina in fragmenta proteinskega fragmenta Astaphylococcusaureus, ki je vezan na njegov N-terminal skozi metioninski ostanek. Gojenje nasičene biomase celic rekombinantnega seva zagotavlja začetek proizvodnje hibridnega proteina, izolacijo in zaporedno transformacijo, ki jo intubus vodi do insulina. Druga skupina raziskovalcev je v bakterijskem ekspresijskem sistemu prejela fuzijski rekombinantni protein, ki je sestavljen iz humanega proinzulina in polihistidinskega repa, ki je bil povezan z metioninskim ostankom. Izolirali smo s kelatno kromatografijo na Ni-agaroznih kolonah iz inkluzijskih teles in razgradili s cianogen bromidom. Avtorji so ugotovili, da je izolirani protein S-sulfuriran. Kartiranje in analizo masnega spektrometra dobljenega proinzulina, prečiščenega z ionsko izmenjevalno kromatografijo na anionskem izmenjevalniku in RP (reverzna faza) HPLC (visoko zmogljiva tekočinska kromatografija), je pokazala prisotnost disulfidnih mostov, ki ustrezajo disulfidnim mostom iz naravnega humanega proinzulina. Prav tako je poročal o razvoju nove, izboljšane metode za pridobivanje humanega insulina z metodami genskega inženiringa v prokariontskih celicah. Avtorji so ugotovili, da je dobljeni insulin po svoji strukturi in biološki aktivnosti identičen hormonu, ki je izoliran iz trebušne slinavke [5].

Nedavno je bila posebna pozornost posvečena poenostavitvi postopka za proizvodnjo rekombinantnega insulina z metodami genskega inženiringa. Tako je bil pridobljen fuzijski protein, ki je sestavljen iz interlevkinskega vodilnega peptida, vezanega na N-konec proinzulina, preko lizinskega ostanka. Protein je bil učinkovito izražen in lokaliziran v inkluzijskih telesih. Po izolaciji je bil protein razcepljen s tripsinom, da nastane insulin in C-peptid. Druga skupina raziskovalcev je delovala na podoben način. Fuzijski protein, ki sestoji iz proinzulina in dveh sintetičnih domen Staphylococcus proteina A, ki vežeta IgG, je bil lokaliziran v inkluzijskih telesih, vendar je imel višjo stopnjo izražanja. Protein smo izolirali z afinitetno kromatografijo z uporabo IgG in obdelali s tripsinom in karboksipeptidazo B. Nastali insulin in C-peptid smo očistili z RP-HPLC. Pri ustvarjanju fuzijskih struktur je masno razmerje nosilnega proteina na ciljni polipeptid zelo pomembno. Tako je opisana zasnova fuzijskih konstruktov, kjer smo kot nosilni polipeptid uporabili protein, ki veže humani serumski albumin. Na njega so bili vezani eden, tri in sedem C-peptidov. C-peptide smo združili na osnovi glave z uporabo aminokislinskih spacerjev, ki so nosili Sfi I restrikcijsko mesto in dva argininska ostanka na začetku in na koncu vmesnika za nadaljnje cepitev proteina s tripsinom. Produkti HPLC cepitve so pokazali, da je C-peptid razcepljen kvantitativno, kar omogoča uporabo metode multimernih sintetičnih genov za proizvodnjo ciljnih polipeptidov v industrijskem obsegu.

Pridobitev mutantnega proinzulina, ki je vseboval nadomestitev Arg32Tyr. S skupno cepitvijo tega proteina z tripsinom in karboksipeptidazo B smo tvorili nativni insulin in C-peptid, ki sta vsebovala tirozinski ostanek. Slednji se po 125I označevanju aktivno uporablja v radioimunskem testu [6].

Nadzor kakovosti insulina

Vsebina

1. Splošne informacije o pridobivanju insulina 5

2. Metode, uporabljene za nadzor kakovosti insulina 8

Reference 17

Odlomek iz dela

1-2% evropskega prebivalstva trpi za sladkorno boleznijo in približno 20% teh bolnikov ne more obstajati brez injekcij inzulina. Od prvih poskusov uporabe insulina za zdravljenje sladkorne bolezni leta 1922 je bil ta hormon izoliran iz trebušne slinavke živali (krav in prašičev). Živalski insulin se pri aminokislinskem zaporedju nekoliko razlikuje od humanega insulina.

Še posebej so blizu človeški in prašičji insulini: pri prašičjem insulinu je C-terminalni treonin B-verige nadomeščen z alaninom. Krava in humani insulin se razlikujeta v treh aminokislinskih ostankih. Te razlike so pokazale povečano imunogeno aktivnost govejega insulina v primerjavi s prašičjim insulinom.

Skoraj vsi bolniki, ki so bili zdravljeni s kravjim insulinom, so imeli protitelesa proti insulinu v krvi. Antigenske lastnosti inzulina so bile delno določene tudi z nečistočami v njegovih pripravkih. Najverjetneje je nastajanje protiteles proti insulinu pojasnilo nekatere manjše stranske učinke pri injiciranju insulina iz krave, na primer atrofijo podkožne maščobe na mestu ponovnega injiciranja. V primeru visoko prečiščenega insulina ti učinki niso bili prisotni.

Kasneje, zahvaljujoč genskemu inženirstvu in uporabi E. Coli, smo dobili humani insulin.

Človeški insulin, pridobljen z E. coli, je bil prvi "gensko spremenjen" protein, testiran pri ljudeh. V poskusih z zdravimi prostovoljci je bilo ugotovljeno, da je varna (ne povzroča alergijskih in drugih neželenih reakcij) in da lahko zmanjša raven glukoze v krvi, če jo dajemo pod kožo ali intravensko.

Trenutno takšen humani insulin pridobijo številni diabetiki po vsem svetu. Pred tem so opravili klinična preskušanja, v katerih so proučevali presnovne spremembe in imunološke učinke.

Pomembnost naše teme je, da lahko nenadzorovana ali slabo nadzorovana proizvodnja privede do sproščanja kontaminiranih pripravkov insulina, kar lahko povzroči neželene klinične posledice.

Namen tega dela je preučiti metode, ki se uporabljajo pri kontroli kakovosti insulina.

Reference

GOST R 52249-2004 "Pravila za proizvodnjo in nadzor kakovosti zdravil" 2004

OFS 42-0002-00 „Bakterijski endotoksini“ 2000

OFS 42-0126-09 "Biološko testiranje insulina"

Farmakopejski članek Ruske federacije FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Genetski inženiring humanega insulina: uspehi in perspektive // Ruska kemijska revija. - 2005. - T. XLIX. - št. 1. - str.

Goncharenko G.G. Osnove biotehnologije: učna metoda. kompleks za stud.biolog. posebno / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min obr. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 str.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Uporaba kinetično-kromogene metode za določanje bakterijskega endotoksina (LAL-test) v tehnologiji čiščenja gensko spremenjenega človeškega insulina // Biopharmaceutical journal - 2009. - Vol. - №1. - str.