Tehnologija proizvodnje insulina

Preprečevanje

Inzulin je eden izmed hormonov, ki jih proizvaja človeško telo, predvsem trebušna slinavka. Kršitev izločanja te snovi povzroči nastanek tako hude bolezni, kot je diabetes. Za njeno zdravljenje z uporabo sintetičnega hormona, ki je dolgo časa izoliran iz trebušne slinavke živine. Vendar pa se tehnologija za proizvodnjo insulina s pomočjo zelo običajne bakterije - Escherichia coli ali glivice iz kvasa uporablja že dolgo časa. Z uporabo te metode se lahko izognete alergijskim reakcijam, ki jih povzročajo tuji proteini, ki imajo rahlo razliko od človeka.

Tehnološka shema

Tehnologija proizvodnje insulina vključuje vse glavne faze proizvodnje biotehnoloških izdelkov. Rezultat je kristalni končni produkt, ki ga nato uporabimo za pripravo injekcijskih raztopin, ki se uporabljajo pri zdravljenju hude sladkorne bolezni tipa I in II. Glavni učinek tega hormona v telesu se kaže v zmanjšanju ravni glukoze v krvi.

Faze proizvodnje insulina bodo naslednje: t

Predhodno. Opravlja postopke, kot so priprava in čiščenje vode in zraka, čiščenje industrijskih prostorov in sterilizacija opreme, pregled osebja, obdelava rok in izdajanje sterilnih čevljev in oblačil. Tudi na začetni stopnji se izvede primarna kemijska sinteza molekularnih verig, iz katerih je sestavljena beljakovina. Veriga A vsebuje 21 aminokislinskih ostankov in veriga B vsebuje 30 aminokislin.
Priprava hranilnih raztopin in celične kulture. Da bi živa celica proizvedla potrebno spojino, smo uvedli ustrezen gen. Za to se plazmid razreže s posebnimi encimi, restrikcijami in v njega so sešiti geni, ki kodirajo sintezo potrebnih spojin. Nato se z uporabo metode mikroinjekcije modificirani plazmid vrne v celico.
Gojenje celične suspenzije. Gensko spremenjene celice se vnesejo v hranilno raztopino, ki ima vse sestavine, potrebne za rast in razmnoževanje ter se sterilizira. Pridelava kulture poteka v posebnih bioreaktorjih, kjer se dovajamo predhodno prečiščeni zrak. Občasno se v reaktor doda določena količina hranilne raztopine in istočasno odvzame enak volumen celične suspenzije.
Dodelitev kulture. Ločevanje tekočine in celične kulture poteka s sedimentacijo (sedimentacijo) v posebnih sedimentatorjih in nato s filtracijo, ki omogoča ohranitev celovitosti celic.
Kromatografsko čiščenje snovi. T Izvaja se na ustrezni opremi z različnimi metodami, zlasti s frontalno, anionsko izmenjevalno in gelsko permeacijsko kromatografijo.
Pridobivanje proteinske molekule. Na dejanski biotehnološki stopnji pride do sinteze neproduktirane molekule insulina. In dve komponenti njenih verig. Po oksidaciji in prepogibanju pridobljenih verig se jih sešita, kar ima za posledico tvorbo disulfidnih mostov.
Liofilizacijo v posebni pečici, nato pa se preveri skladnost kristaliničnega pripravka s standardom, pakira, označi in odpremi potrošniku.

Naše podjetje pod ugodnimi pogoji ponuja konfekcijske proizvodne linije, kjer je v celoti izpolnjena vsa tehnologija proizvodnje insulina. Zaradi natančnih izračunov, tehnične in informacijske podpore ter usposabljanja osebja v okviru celovitega programa bo podjetje dobičkonosno, njegovi izdelki pa bodo v povpraševanju.

Vrste insulina in metode za njegovo proizvodnjo

1. Vrste insulina

2. Pridobivanje insulina

Insulin (iz latinščine Insula - otok) je peptidni hormon, ki nastane v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Ima večplasten učinek na presnovo v skoraj vseh tkivih.

Glavna funkcija insulina je zagotoviti prepustnost celičnih membran za molekule glukoze. V poenostavljeni obliki lahko rečemo, da se ne le ogljikovi hidrati, ampak tudi vsa hranila delijo na glukozo, ki se uporablja za sintezo drugih molekul, ki vsebujejo ogljik, in je edina vrsta goriva za celične elektrarne - mitohondrije. Brez insulina prepustnost celične membrane do glukoze pade 20-krat, celice pa umrejo od stradanja, presežek sladkorja pa se raztopi v krvi.

Oslabitev izločanja insulina zaradi uničenja beta celic - absolutno pomanjkanje insulina - je ključni element pri patogenezi diabetesa mellitusa tipa 1. t Kršitev učinka insulina na tkivo - relativno pomanjkanje insulina - ima pomembno mesto pri razvoju sladkorne bolezni tipa 2. t

Zgodovina odkrivanja insulina je povezana z imenom ruskega zdravnika I.M. Sobolev (druga polovica 19. stoletja), ki je dokazal, da raven sladkorja v človeški krvi ureja poseben hormon trebušne slinavke.

Leta 1922 je insulin, izoliran iz trebušne slinavke živali, prvič predstavil desetletnemu diabetičnemu fantu. rezultat je presegel vsa pričakovanja, leto kasneje pa je ameriška družba Eli Lilly izdala prvi živalski insulinski pripravek.

Po prejemu prve industrijske serije inzulina v naslednjih nekaj letih je bil prečrtan velik način njegove izolacije in čiščenja. Posledično je hormon postal na voljo bolnikom s sladkorno boleznijo tipa 1.

Leta 1935 je danski raziskovalec Hagedorn optimiziral delovanje insulina v telesu s predlogom za podaljšano zdravljenje.

Prvi insulinski kristali so bili pridobljeni leta 1952, leta 1954 pa je angleški biokemik G. Senger dešifriral strukturo insulina. Razvoj metod za čiščenje hormona iz drugih hormonskih snovi in produktov razgradnje insulina je omogočil pridobitev homogenega insulina, imenovanega enokomponentni insulin.

V začetku 70-ih let Gg. Sovjetski znanstveniki A. Yudaev in S. Shvachkin predlagala kemično sintezo insulina, vendar je izvajanje te sinteze na industrijski ravni je bilo drago in nedonosnih.

V prihodnosti se je postopno izboljšala stopnja čiščenja insulinov, kar je zmanjšalo težave, ki jih povzročajo alergije na insulin, okvarjeno delovanje ledvic, okvaro vida in odpornost na imunski insulin. Najučinkovitejši hormon je bil potreben za nadomestno zdravljenje pri sladkorni bolezni - homologni insulin, tj. Humani insulin.

V osemdesetih letih je napredek v molekularni biologiji omogočil sintezo obeh verig človeškega inzulina z uporabo E.coli, ki sta bili nato povezani v biološko aktivno hormonsko molekulo, rekombinantni insulin pa je bil pridobljen na Inštitutu za bioorgansko kemijo Ruske akademije znanosti z gensko spremenjenimi sevi E.coli.

Uporaba afinitetne kromatografije je bistveno zmanjšala vsebnost kontaminiranih beljakovin v pripravku z višjo molekulsko maso kot insulin. Takšni proteini vključujejo proinzulin in delno razcepljene proinsuline, ki so sposobni inducirati produkcijo antiinsulinskih protiteles.

Uporaba človeškega insulina od samega začetka zdravljenja zmanjša pojav alergijskih reakcij. Človeški insulin se hitreje absorbira in ima, ne glede na obliko zdravila, krajši čas delovanja kot živalski insulin. Človeški insulini so manj imunogeni kot svinjina, zlasti mešani goveji in prašičji insulini.

1. Vrste insulina

Pripravki insulina se razlikujejo po stopnji čiščenja; vir prejema (govedo, prašiči, ljudi); snovi, dodane raztopini insulina (podaljšanje njenega delovanja, bakteriostatiki itd.); koncentracija; vrednost pH; možnost mešanja ICD s SDI.

Pripravki insulina se razlikujejo glede na vir. Prašičji in goveji insulin se od človeka razlikuje po aminokislinski sestavi: bovini v treh aminokislinah in prašičih v eni. Ni presenetljivo, da se pri zdravljenju z govejim insulinom neželeni učinki pojavijo veliko pogosteje kot pri zdravljenju s prašičjim ali humanim insulinom. Te reakcije so izražene v imunološki odpornosti proti insulinu, alergiji na insulin, lipodistrofiji (sprememba podkožne maščobe na mestu injiciranja).

Kljub očitnim pomanjkljivostim govejega insulina se še vedno široko uporablja v svetu. In vendar, imunološko, so pomanjkljivosti govejega insulina očitne: v nobenem primeru ni priporočljivo, da se predpiše bolnikom z na novo diagnosticirano sladkorno boleznijo, nosečnicami ali za kratkotrajno insulinsko zdravljenje, na primer v perioperativnem obdobju. Tudi negativne lastnosti govejega insulina se ohranijo, kadar se uporabljajo v mešanici s prašiči, zato se pri zdravljenju teh kategorij bolnikov ne sme uporabljati tudi mešanih (prašičji + goveji) insulini.

Pripravki humanega insulina za kemijsko strukturo so popolnoma identični humanemu insulinu.

Glavni problem biosintetične metode pridobivanja humanega insulina je popolno čiščenje končnega produkta iz najmanjših nečistoč uporabljenih mikroorganizmov in njihovih presnovnih produktov. Nove metode nadzora kakovosti zagotavljajo, da človeški biosintetični insulin zgoraj navedenih proizvajalcev ne vsebuje nobenih škodljivih nečistoč; zato njihova stopnja čiščenja in učinkovitost zniževanja glukoze izpolnjujejo najvišje zahteve in so skoraj enaki. Neželeni stranski učinki, odvisno od nečistoč, teh zdravil nimajo insulina.

Trenutno se v medicinski praksi uporabljajo tri vrste insulinov:

- kratkega dosega s hitrim začetkom učinka;

- povprečno trajanje ukrepa;

- dolgim delovanjem s počasnim učinkom.

Tabela 1. Značilnosti komercialnih pripravkov insulina

Kratkodelujoči insulin (ICD) - navaden insulin - je kratko delujoč kristalni insulin, ki je topen pri nevtralnem pH, katerega učinek se razvije v 15 minutah po subkutani uporabi in traja 5-7 ur.

Prvi podaljšani insulin (SDI) je nastal v poznih 30-ih letih, tako da so lahko bolniki injicirali manj pogosto kot pri uporabi ICD-ja, če je bilo mogoče enkrat na dan. Za povečanje trajanja delovanja se vsi drugi pripravki insulina modificirajo in, če so raztopljeni v nevtralnem mediju, tvorijo suspenzijo. Vsebujejo protamin v fosfatnem pufru - protamin cink-inzulin in NPH (nevtralni protamin Hagedorn) - NPH-insulin ali različne koncentracije cinka v acetatnem pufru - insulin ultralente, trak, sedemdeset.

Srednje trajni pripravki insulina vsebujejo protamin, ki je beljakovina povprečnega m. 4400, bogata z argininom in pridobljena iz mavričnega šarenke. Za oblikovanje kompleksa je potrebno razmerje protamina in insulina 1:10. Po subkutani uporabi so proteolitični encimi uničili protamin, kar omogoča, da se insulin absorbira.

NPH-insulin ne spremeni farmakokinetičnega profila regulatornega insulina z njim. NPH-inzulin je bolj zaželen kot inzulinski trak kot sestavni del povprečnega trajanja delovanja v terapevtskih mešanicah, ki vsebujejo običajni insulin.

V fosfatnem pufru vsi insulini zlahka tvorijo kristale s cinkom, toda samo kristali govejega insulina so dovolj hidrofobni, da zagotovijo počasno in enakomerno sproščanje insulina, značilnega za ultralente. Cinkovi kristali prašičjega inzulina se raztopijo hitreje, učinek pride prej, trajanje delovanja je krajše. Zato ni zdravila ultralente, ki vsebuje samo prašičji inzulin. Monokomponentni prašičji insulin se proizvaja pod imenom suspenzija insulina, insulin nevtralna, insulin izofan, insulinski aminokinurid.

Insulinski trak je mešanica 30% insulina semilenta (amorfni insulinski precipitat z cinkovimi ioni v acetatnem pufru, katerega učinek razprši relativno hitro) s 70% insulina ultralente (slabo topen kristalni insulin, ki ima poznejši začetek in podaljšano delovanje). Ti dve komponenti zagotavljata kombinacijo z relativno hitro absorpcijo in stabilnim dolgoročnim delovanjem, zaradi česar je inzulinski trak priročno terapevtsko sredstvo.

2. Pridobivanje insulina

Človeški insulin se lahko proizvaja na štiri načine:

1) popolna kemijska sinteza;

2) ekstrakcija iz trebušne slinavke osebe (obe metodi nista primerni zaradi neučinkovitosti: nezadosten razvoj prve metode in pomanjkanje surovin za množično proizvodnjo po drugi metodi);

3) s polsintetično metodo z uporabo encimsko-kemijske substitucije na položaju 30 B-verige amino kisline alanina v prašičnem insulinu s treoninom;

4) biosintetična metoda za tehnologijo genskega inženiringa. Zadnji dve metodi omogočata pridobitev humanega insulina visoke čistosti.

Trenutno se humani insulin večinoma dobiva na dva načina: s spreminjanjem svinjskega insulina s sintetično-encimsko metodo in z metodo genskega inženiringa.

Insulin je bil prvi protein, pridobljen za komercialne namene z uporabo tehnologije rekombinantne DNA. Obstajata dva glavna pristopa za pridobivanje gensko spremenjenega humanega insulina.

V prvem primeru ločeni (različni sevi proizvajalcev) proizvajajo obe verigi, ki ji sledi zlaganje molekule (tvorba disulfidnih mostov) in ločevanje izooblik.

V drugem pripravku v obliki prekurzorja (proinzulina), ki mu sledi encimsko cepitev s tripsinom in karboksipeptidazo B v aktivno obliko hormona. Trenutno je najprimernejše, da dobimo insulin kot prekurzor, ki zagotavlja pravilno zapiranje disulfidnih mostov (v primeru ločene proizvodnje verig izvedemo zaporedne cikle denaturacije, ločevanje izooblik in renaturacijo).

V obeh pristopih je mogoče tako posamično pridobiti izhodne komponente (A in B verige ali proinzulin) in kot del hibridnih proteinov. Poleg A- in B-verig ali proinzulina je lahko prisotna tudi v sestavi hibridnih proteinov:

- proteinski nosilec, ki zagotavlja transport hibridnega proteina v periplazmičnem prostoru celičnega ali kulturnega medija;

- komponento afinitete, ki močno olajša izbiro hibridnega proteina.

Hkrati sta lahko obe komponenti sočasno prisotni v sestavi hibridnega proteina. Poleg tega lahko pri ustvarjanju hibridnih proteinov uporabimo načelo večdimenzionalnosti (to je, da je v hibridnem proteinu prisotnih več kopij ciljnega polipeptida), kar omogoča bistveno povečanje donosa ciljnega produkta.

V Veliki Britaniji sta bili obe verigi humanega insulina sintetizirani z uporabo E.coli, ki sta bili nato povezani z biološko aktivno molekulo hormona. Da bi enocelični organizem na svojih ribosomih sintetiziral molekule insulina, je potrebno zagotoviti potreben program, to je, da se mu vnese gen za hormon.

Kemično pridobimo gensko programirno biosintezo prekurzorja insulina ali dveh genov, programiramo ločeno biosintezo insulinskih verig A in B. t

Naslednja stopnja je vključitev gena za prekurzor insulina (ali verig gena ločeno) v genom E. coli, posebnega seva E. coli, ki se goji v laboratorijskih pogojih. To nalogo opravlja genski inženiring.

Plazmid izoliramo iz E. coli z ustreznim restrikcijskim encimom. Sintetični gen vstavimo v plazmid (kloniranje s funkcionalno aktivnim C-terminalnim delom P-galaktozidaze E. coli). Kot rezultat, E.coli pridobi sposobnost sintetiziranja proteinske verige, sestavljene iz galaktozidaze in insulina. Sintetizirani polipeptidi se kemično cepijo iz encima in nato očistijo. Pri bakterijah se na bakterijsko celico sintetizira približno 100.000 molekul insulina.

Naravo hormonske snovi, ki jo proizvaja E. coli, določamo s tem, kateri gen je vstavljen v genom enoceličnega organizma. Če je kloniran insulinski prekurzorni gen, bakterija sintetizira prekurzor insulina, ki ga nato izpostavimo obdelavi z restrikcijskimi encimi, da odstranimo prepity z izolacijo C-peptida, kar povzroči biološko aktiven insulin.

Za pridobitev prečiščenega humanega insulina je hibridni protein, izoliran iz biomase, izpostavljen kemijsko-encimatskemu preoblikovanju in ustreznemu kromatografskemu čiščenju (primarna, gelska penetracija, anionska izmenjava).

Rekombinantni insulin smo pridobili na Inštitutu RAS z uporabo gensko spremenjenih sevov E.coli. Iz gojene biomase se sprosti prekurzor, hibridni protein, izražen v količini 40% celotnega celičnega proteina, ki vsebuje preproinzulin. Njena pretvorba v inzulin in vitro poteka v enakem zaporedju kot in vivo - vodilni polipeptid se cepi, preproinzulin se pretvori v insulin s stopnjami oksidativne sulfitolize, čemur sledi reduktivno zaprtje treh disulfidnih vezi in encimska izolacija vezave C-peptida. Po seriji kromatografskih čiščenj, vključno z ionsko izmenjavo, gelom in HPLC, dobimo humani insulin visoke čistosti in naravne aktivnosti.

Uporabimo lahko sev s plazmidno vgrajeno nukleotidno sekvenco, ki eksprimira fuzijski protein, ki je sestavljen iz linearnega proinzulina in Staphylococcus aureus proteina fragmenta A, vezanega na njegov N-terminus.

Gojenje nasičene biomase celic rekombinantnega seva zagotavlja začetek proizvodnje hibridnega proteina, izolacijo in zaporedno transformacijo, ki v cevi vodi do insulina.

Možen je tudi drug način: v bakterijskem ekspresijskem sistemu se izkaže fuzijski rekombinantni protein, ki sestoji iz človeškega proinzulina in polihistidinskega repa, ki je z njim povezan preko metioninskega ostanka. Izolira se z uporabo kelatne kromatografije na Ni-agaroznih kolonah iz inkluzijskih teles in razgradi s cianogen bromidom.

Izolirani protein je S-sulfoniran. Kartiranje in masna spektrometrična analiza pridobljenega proinzulina, očiščenega z ionsko izmenjevalno kromatografijo na anionskem izmenjevalniku in RP (reverzna faza) HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti), kaže prisotnost disulfidnih mostov, ki ustrezajo disulfidnim mostovom iz naravnega humanega proinzulina.

Nedavno je bila posebna pozornost posvečena poenostavitvi postopka za proizvodnjo rekombinantnega insulina z metodami genskega inženiringa. Na primer, možno je dobiti fuzijski protein, ki sestoji iz vodilnega peptida interlevkina 2, vezanega na N-konec proinzulina, preko lizinskega ostanka. Protein je učinkovito izražen in lokaliziran v inkluzijskih telesih. Po izolaciji se protein razcepi s tripsinom, da nastane insulin in C-peptid.

Nastali insulin in C-peptid očistimo z RP HPLC. Pri ustvarjanju fuzijskih struktur je masno razmerje nosilnega proteina na ciljni polipeptid zelo pomembno. C-peptide povežemo s principom repa glave z aminokislinskimi ločevalci, ki nosijo restrikcijsko mesto Sfi I in dvema argininskima ostankoma na začetku in na koncu vmesnika za nadaljnje cepitev proteina s tripsinom. Produkti HPLC cepitve kažejo, da je cepitev C-peptida kvantitativna, kar omogoča uporabo metode multimernih sintetičnih genov za pridobivanje ciljnih polipeptidov v industrijskem merilu.

Diabetes mellitus je kronična bolezen, ki jo povzroča absolutna ali relativna pomanjkanje insulina. Zanj je značilna globoka presnovna motnja ogljikovih hidratov s hiperglikemijo in glukozurijo ter drugimi presnovnimi motnjami, ki so posledica številnih genetskih in zunanjih dejavnikov.

Inzulin doslej služi kot radikalen in v večini primerov edini način za ohranitev življenja in invalidnosti ljudi s sladkorno boleznijo. Pred prejemanjem in vnosom insulina v kliniko leta 1922-1923. Bolniki z diabetesom mellitusom tipa I so čakali na smrtonosni izid za eno do dve leti od začetka bolezni, kljub uporabi najbolj izčrpavajočih diet. Pri bolnikih s sladkorno boleznijo tipa I potrebujem vseživljenjsko nadomestno zdravljenje z insulinom. Prenehanje zaradi različnih razlogov za redno uvedbo insulina vodi do hitrega razvoja zapletov in neposredne smrti pacienta.

Trenutno je sladkorna bolezen glede razširjenosti na tretjem mestu po srčno-žilnih in onkoloških boleznih. Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije je razširjenost sladkorne bolezni med odraslo populacijo v večini regij na svetu 2-5% in obstaja tendenca povečanja števila bolnikov skoraj dvakrat vsakih 15 let. Kljub očitnemu napredku na področju zdravstvenega varstva se število bolnikov, odvisnih od insulina, vsako leto povečuje in trenutno samo v Rusiji je približno 2 milijona ljudi.

Ustvarjanje zdravil domačega človeškega genskega insulina odpira nove možnosti za reševanje mnogih problemov diabetologije v Rusiji, da bi rešili življenja milijonov ljudi s sladkorno boleznijo.

Biotehnologija: Učbenik za srednje šole / Ed. N.S. Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Višja šola, 1987, str. 15-25.

Humani inzulin genskega inženiringa. Izboljšanje učinkovitosti kromatografskega ločevanja z uporabo načela bifunkcionalnosti. Romanchikov, AB, Yakimov, S.A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, AM, Vulfson, A.N. // Bioorganska kemija, 1997 - 23, št

Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija. Načela in uporaba. M: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Sodobne metode ustvarjanja industrijskih sevov mikroorganizmov // Biotehnologija. Princ 2. M: Višja šola, 1988. 208 str.

Imobilizacija tripsina in karboksipeptidaze B na modificiranem silicijevem dioksidu in njihova uporaba pri pretvorbi rekombinantnega humanega proinzulina v insulin. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Kemični farmacevtski izdelki. J., 1995 - 29, št. 1, str. 61 - 64.

Molekularna biologija. Struktura in funkcija beljakovin / Stepanov V. M. / / Moskva, gimnazija, 1996.

Osnove farmacevtske biotehnologije: Študijski vodnik / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov na Donu: Phoenix; Tomsk: Založba NTL, 2006.

Sinteza fragmentov insulina in preučevanje njihovih fizikalno-kemijskih in imunoloških lastnosti. / Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997–23, št. 12, str. 953–960.

Predpisi za proizvodnjo gensko spremenjene metode insulina

Domov> Predstavitev> Medicina, zdravje

Državna izobraževalna ustanova

višjega poklicnega izobraževanja

Kurska državna medicinska univerza

Zvezna agencija za zdravje in socialni razvoj

Oddelek za farmacevtsko tehnologijo

za pridobitev gensko spremenjenega insulina z biotehnologijo rDNA

5. letnik 5 skupin

Dr. Maravina I.N.

Oddelek I. Značilnosti končnega izdelka 3

Oddelek II. Značilnosti surovin 5

Oddelek III. Shema kemične proizvodnje 6

Oddelek IV. Tehnološka shema proizvodnje 7

Oddelek V. Grafika proizvodnih tokov in specifikacija

Oddelek VI. Izjava o postopku 10

Oddelek VII. Metode analize 14

Oddelek VIII. Varnost, požarna varnost,

industrijska sanitacija 16

Oddelek IX. Seznam navodil za proizvodnjo 17

Oddelek I. Značilnosti končnega izdelka

Suha insulinska biomasa

Opis. Raztopine insulina so bistra, brezbarvna ali rahlo rumenkasta kisla tekočina (pH 2,0–3,5), pripravljena z razredčenjem kristaliničnega insulina v vodi, nakisanim s klorovodikovo kislino, z dodatkom glicerola in 0,25–0,30% fenola ali raztopine tricresola. za konzerviranje.

Hipoglikemično sredstvo, kratkodelujoči insulin. Deluje s specifičnim receptorjem v zunanji membrani celic in tvori insulinski receptorski kompleks. Z aktivacijo biosinteze cAMP v maščobnih celicah in jetrnih celicah ali neposredno penetrirajočih mišičnih celicah, insulinski receptorski kompleks stimulira znotrajcelične procese, vključno z t sinteza številnih ključnih encimov (heksokinaze, piruvat kinaze, glikogen sintetaze itd.). Zmanjšanje glukoze v krvi je posledica povečanja znotrajceličnega transporta, povečane absorpcije in absorpcije v tkivih, stimulacije lipogeneze, glikogenogeneze, sinteze beljakovin, zmanjšanja proizvodnje glukoze v jetrih itd. Trajanje delovanja pripravkov insulina je predvsem posledica absorpcije. (od odmerka, metode in mesta injiciranja). Po p / do začetka učinka - po 0,5 h, največji učinek - po 1-3 urah, trajanje delovanja - 8 ur.

Diabetes mellitus tipa 1 (odvisen od insulina). Diabetes mellitus tipa 2 (neodvisen od insulina): stopnja odpornosti proti peroralnim hipoglikemičnim zdravilom, delna odpornost na ta zdravila (med kombiniranim zdravljenjem), medsebojne bolezni, nosečnost.

Na začetku terapije - motnje vida, otekanje okončin. Z uvedbo prevelikih odmerkov insulina ali kršitvijo prehrane (preskok obrokov), kot tudi prekomerno vadbo, hipoglikemijo (hladen znoj, bleda koža, živčnost, tresenje, tesnoba, prekomerna utrujenost ali šibkost, zmedenost, omotičnost, glavobol, izrazit občutek lakote, začasna prizadetost vida, slabost, tahikardija, v hudih primerih - izguba zavesti, koma). Sistemske alergijske reakcije: povečano znojenje, bruhanje, oteženo dihanje, palpitacije, omotica.

Rok uporabnosti - 1 leto od datuma proizvodnje.

Oddelek II. Značilnosti surovin

Verige genov, ki kodirajo sintezo verig A in B

Kemično sintetiziran

Kultura mora biti čista

Štirislojne papirne vrečke

Tkanine iz bombaža

Oddelek III. Shema kemijske proizvodnje

Kemičnih transformacij v proizvodnji gensko spremenjenega insulina ni.

Oddelek IV Tehnološka shema za proizvodnjo insulina

Priprava prostorov in opreme

Sanitarna predelovalna proizvodnja

Priprava tehnoloških oblačil

Sinteza verig A in B

Vnos genov v plazmid

Uvajanje r-DNA v permisivno celico

Priprava hranil

Kultura suspenzije gojenja

Pridobivanje molekule insulina

Po kazalnikih FS

Instrumentalna proizvodna shema in specifikacija opreme

1 - Kemični reaktor

2 - Vnos genov v plazmid

4 - Enota za stalno sterilizacijo

5 - Industrijski bioreaktor

6 - Izbira verig

7 - Kromatografska instalacija

8 - pridobivanje molekule insulina

9 - Liofilizator

10 - Analitična tabela

Oddelek VI. Opis procesa

BP 1. Priprava vode

Membrane destilatorji so namenjeni za pridobivanje desalinizirane vode, ki izpolnjuje zahteve GOST 6709-97 "Destilirana voda". Produktivnost destilatorjev - od 3 do 15 l / uro (laboratorijske instalacije v ekonomičnem kompletu), od 5-30 l / h (laboratorijske instalacije). Postopek filtracije vključuje naslednje stopnje: predobdelava na aktivnem oglju, membranska filtracija in deionizacija vode z ionskimi izmenjevalnimi smolami. Predfilter odstrani suspendirane delce, klor, visoko molekularno organsko snov in ione težkih kovin iz vhodne vode iz pipe. Membranska filtracija temelji na pojavu reverzne osmoze, v kateri se voda, ki prehaja skozi polprepustno membrano, očisti iz raztopljenih soli, organskih nečistoč z nizko molekulsko maso, bakterij in mikroorganizmov. Na filtru z ionsko izmenjevalnimi smolami je popolno prečiščevanje filtrata iz raztopljenih soli.

BP 2. Sanitarna predelava proizvodnje.

BP 2.1. V prostorih za proizvodnjo sterilnih farmacevtskih oblik so postavljene naslednje zahteve: t

Hraniti je treba v brezhibni čistoči, ob obveznem vsakodnevnem in splošnem čiščenju ter rednih popravilih;

Lahko je izpostavljena UV-sevanju za dezinfekcijo zraka z uporabo stacionarnih ali prenosnih obsevalnikov;

Imeti mora razsvetljavo, temperaturo, vlažnost in prezračevanje, ki nimajo neposrednega ali posrednega negativnega vpliva na kakovost končnih izdelkov;

Vsebovati mora minimum, ki je potreben za vodenje proizvodnega procesa, količino opreme in pohištva;

Spajanje med stenami, tlemi in stropom mora imeti zaokroženo obliko;

V prostorih I in II razredov čistoče ne sme biti odprtih komunikacij, zračnih kanalov;

Prostori višjega razreda čistoče morajo biti v prostoru nižjega razreda čistoče. Dostop osebja in surovin v čisto sobo se izvaja samo prek zračnih prehodov, ki so opremljeni s preskrbo s sterilnim zrakom po shemi »od zgoraj navzdol«;

Prenos končnega izdelka je treba izvesti z uporabo transporterja, ki poteka skozi stene.

BP 2.2. Priprava opreme

Zahteve za pripravo opreme:

Oprema mora biti zasnovana in nameščena tako, da se njeno delovanje, vzdrževanje in popravila lahko izvajajo zunaj „čistih“ prostorov;

Oprema, ki se uporablja za delo v aseptičnih pogojih, mora imeti zapisovalne naprave za spremljanje procesnih parametrov in prisotnost alarmnih naprav za njeno okvaro;

Oprema mora biti očiščena, razkužena in po potrebi sterilizirana;

Opremo je treba nadzorovati glede mikrobiološke čistosti;

Delovna površina opreme mora biti gladka, od nestrupenega in nerjavečega materiala.

BP 2.3. Usposabljanje osebja

Zahteve za osebje: t

Osebje mora imeti določeno minimalno znanje o higieni, higieni in pravilih GMP;

Zaposleni z nalezljivimi boleznimi, odprtimi ranami na koži in nosilci patogene mikroflore ne smejo delati;

Prepovedano je govoriti, jesti hrano, se hitro gibati na delovnem mestu;

Strogo upoštevajte osebno higieno, odstranite kozmetiko z obraza in odstranite nakit, preden vstopite v "čisto" sobo;

Tuš, umijte in očistite roke z razkužili, nanesite na sterilno tehnološko obleko in čevlje.

BP 3. Sinteza verig A in B.

Sinteza verig izvedemo s kemijsko metodo. Veriga A vsebuje 21 aminokislinskih ostankov, ostanke verige B-30

BP 4. Vnos genov v plazmid.

Da bi plazmid sprejel tuji gen, je njegova veriga razrezana z restrikcijskimi encimi. Za povezovanje genov, ki kodirajo sintezo verig A in B, se uporabljajo oligosaharidni ostanki različnih dolžin - povezovalci in adapterji. Ko je molekula zaprta, jo lahko vnesete v permisivno celico.

BP 5. Vnos r-DNA v permisivno celico.

Uvedba p = DNA v E.coli celico se izvede z mikroinjekcijo: plazmid, ki vsebuje vektorsko DNA, se injicira v E.coli celico s posebno ultrathin stekleno iglo.

TP 6. Priprava hranilnega medija

Glavni hranilni medij za gojenje kulture E. coli je juha po Millerju. Sestavine: kazein hidrolizat, kvasni ekstrakt, natrijev klorid, agar-agar. Končna vrednost pH (pri 25 ° C) je 7,0 ± 0,2. Uporablja se tudi Hottingerjeva juha. Sestavine: Hottingerjev hidrolizat, natrijev klorid, destilirana voda.

Sterilizacija hranilnega medija poteka v stroju za kontinuirano sterilizacijo - ONS. Hranilni medij zaporedoma prehaja skozi ogrevalni odsek, držalni odsek in hladilni del.

TP 7. Gojenje suspenzijske kulture

Gojenje biokulture poteka v bioreaktorjih, suspenzijska kultura, v kateri je mešanica zaradi dovajanja zraka v bioreaktor. Postopek se izvaja v pol-periodičnem načinu, ko se bioreatorju stalno dodaja določena količina svežega hranilnega medija in se hkrati vzame enak volumen celične suspenzije.

TP 8. Izolacija tkivne kulture.

Ločevanje kulture tkiv od hranilnega medija poteka po metodi sedimentacije (sedimentacije) v sedimentatorjih, globlje ločevanje pa se doseže s filtriranjem nežne metode za ohranitev celovitosti celic kulture.

Insulin se prečisti s kromatografskimi metodami: čelna, gelska permeacija, anionska izmenjava. Čiščenje inzulina in njegovih derivatov na sorbentih z močnimi kationsko izmenjalnimi lastnostmi (na primer SP-Sepharose FF) se lahko uporabljajo puferski sistemi na osnovi amonijevega acetata z nizko vsebnostjo sečnine (do 2 M ali manj).

TP 10. Pridobivanje molekule insulina

Izbrane in prečiščene verige so zložene in oksidirane, kar zagotavlja nastanek ustreznih disulfidnih mostov.

Sušenje proizvoda poteka v liofilizatorju.

TP 12. Ocena kakovosti končnega izdelka.

Videz (kot je opisano), aktivnost (biološka metoda).

UMO 13. Pakiranje, označevanje, pošiljanje.

Aktivnost insulina se meri v enotah ukrepanja (ED) ali v mednarodnih enotah ukrepanja (IU - ruski ali IU - angleški ali UI - francoski). Enota ustreza aktivnosti 1/24 mg (41,66 μg) kristaliničnega insulina.

Leta 1922 je Frederick Banting predlagal, da je treba enoto za delovanje insulina obravnavati kot število kubičnih centimetrov ekstrakta trebušne slinavke, ki je v 2-4 urah pripeljala zdravega kunca do hipoglikemije s stopnjo SC 2,5 mmol / L. Malo pozneje v istem letu je ista ekipa predlagala "mišje" enoto - količino insulina, ki je potrebovala konvulzijo polovice poskusne skupine miši (raziskovalci so sprva delovali po analogiji z LD50).

Naslednje leto je Mednarodni odbor za standardizacijo sprejel opredelitev enote za delovanje insulina: "Količina insulina, ki je potrebna za znižanje ravni glukoze v krvi na raven, pri kateri se napadi začnejo pri kuncih, ki tehtajo 2 kg, ki niso bili hranjeni 24 ur." Ta enota, v čast skupine Banting in Best iz Toronta, je bila imenovana toronto enota delovanja insulina.

Leta 1925 je bil uveden prvi mednarodni standard, v katerem je bilo ugotovljeno, da je enota delovanja insulina enaka količini, ki ustreza 1/8 mg kristaliničnega insulina.

Zaradi velikega napredka pri čiščenju insulina in neprijetnosti uporabe tako velike enote leta 1936 je odbor Zveze narodov odobril nov mednarodni standard za delovanje insulina, ki je enoto enačbo izenačil z 1/22 mg kristaliničnega insulina. Leta 1952 je bil standard ponovno spremenjen in enota je bila enačena z 1 / 24,5 mg kristaliničnega insulina, leta 1958 pa se je končno pojavil četrti standard (1 U je enak 1/24 mg kristaliničnega insulina). Svetovna zdravstvena organizacija je leta 1982 naredila najnovejše prilagoditve standarda, ki niso vplivale na opredelitev enote, ampak so se nanašale le na spremembe, povezane s pojavom človeškega gensko spremenjenega insulina.

Oddelek VIII. Varnost, požarna varnost in. T

Vsak delavec in delavec po prejemu dela mora opraviti osnovno poučevanje. Primarni sestanek opravi delovodja ali poveljnik v skladu z naslednjim programom:

Glavne določbe zakonodaje o varstvu delavcev, varnosti, industrijskih sanitarnih razmerah;

Namen in postopek uporabe posebnih oblačil in osebne zaščitne opreme;

Dajatve na delovnem mestu;

Zahteve za pravilno organizacijo in vzdrževanje delovnega mesta;

Splošna pravila za električno varnost, vrednost prezračevanja in pravila za uporabo prezračevalnih sistemov;

Poznavanje tehnološkega procesa, opreme naprave in vseh nevarnih predmetov.

Vsa električna oprema mora ustrezati zahtevam Pravil za delovanje električne opreme. Električna oprema mora biti ozemljena. Vse proizvodne in komunalne prostore, inštalacije, objekte je treba opremiti z opremo za gašenje požara in opremo za gašenje požarov.

Vključitev nepooblaščenih oseb v trgovino je prepovedana.

Oddelek IX. Seznam navodil za proizvodnjo

Navodila za delo za sanitarno obdelavo prostorov.

Navodila za varnost, industrijsko sanitacijo in požarno varnost.

Navodila za pripravo, dostavo in prejem popravila opreme.

Navodila za sprejem surovin in pomožnih materialov;

Načrt odprave nesreč.

Navodila za regeneracijo raztopine.

Navodila za delo za pranje, sušenje in sterilizacijo steklenic.

Navodila za mehaniko za popravila in vzdrževanje cevovodov.

Tehnologija proizvodnje insulina

Insulin.docx

Poglavje 1. Literarni pregled

1.3. Brizge, peresa in inzulinski razpršilniki

1.4 Tehnika injiciranja insulina ……………………………………...

1.5.Faktorji, ki vplivajo na absorpcijo in delovanje insulina.........

1.6. Zapleti insulinskega zdravljenja ……………………………………..

1.7. Pakiranje insulina

1.8. Shranjevanje insulina.

1.9. Sodobni načini za izboljšanje inzulinske terapije...

Poglavje 2. Eksperimentalni del

Insulin (iz latinščine. Insula - otok) - peptidni hormon, nastane v beta celicah Langerhansovih pankreasnih otočkov. Ima večplasten učinek na presnovo v skoraj vseh tkivih.

Število ljudi s sladkorno boleznijo po svetu je 120 milijonov (2,5% prebivalstva). Vsakih 10-15 let se število bolnikov podvoji. Po podatkih Mednarodnega inštituta za diabetes (Avstralija) bo do leta 2010 na svetu 220 milijonov bolnikov. V Ukrajini je približno 1 milijon bolnikov, od katerih jih 10–15% trpi za najhujšo insulinsko odvisno sladkorno boleznijo (tip I). Pravzaprav je število pacientov 2-3 krat več zaradi skritih nediagnosticiranih oblik.

Leta 1935 je danski raziskovalec Hagedorn optimiziral delovanje insulina v telesu s predlogom za podaljšano zdravljenje.

V začetku 70-ih let Gg. Sovjetski znanstveniki A. Yudaev in S. Shvachkin predlagala kemično sintezo insulina, vendar je izvajanje te sinteze na industrijski ravni je bilo drago in nedonosnih.

Namen mojega dela: Študija pripravkov insulina na našem trgu, njihove prednosti in slabosti.

Naloge: Obravnava procesa pridobivanja insulina v industrijski proizvodnji.

Poglavje 1. Literarni pregled

1.1 Pridobivanje insulina

Človeški insulin se lahko proizvaja na štiri načine:

1) popolna kemijska sinteza;

2) ekstrakcija iz trebušne slinavke osebe (obe metodi nista primerni zaradi neučinkovitosti: nezadosten razvoj prve metode in pomanjkanje surovin za množično proizvodnjo po drugi metodi);

3) s polsintetično metodo z uporabo encimsko-kemijske substitucije na položaju 30 B-verige amino kisline alanina v prašičnem insulinu s treoninom;

4) biosintetična metoda za tehnologijo genskega inženiringa. Zadnji dve metodi omogočata pridobitev humanega insulina visoke čistosti.

Razmislite o pridobivanju biosintetičnega insulina v smislu prednosti te metode.

Torej, koristi pridobivanja insulina biosintetično.

Pred uvedbo metode za proizvodnjo insulina z uporabo rekombinantnih mikroorganizmov v industriji je obstajal samo en način za proizvodnjo insulina - iz trebušne slinavke goveda in prašičev. Insulin, pridobljen iz trebušne slinavke goveda, se razlikuje od humanega insulina za 3 aminokislinske ostanke, inzulin, pridobljen iz prašičje žleze, pa je samo en aminokislinski ostanek, to je, da je bližje človeškemu insulinu. Z uvedbo beljakovin, ki se po strukturi razlikujejo od človeških beljakovin, se lahko pojavijo tudi alergijske reakcije tudi v tako manjšem izrazu. Takšen inzulin kot tuji protein se lahko tudi inaktivira v krvi z nastalimi protitelesi.

Poleg tega je za pridobitev 1 kilograma insulina potrebno 35 tisoč prašičev (če je znano, da je letna potreba po insulinu 1 ton zdravila). Po drugi strani pa lahko enako količino insulina pridobimo biosintetično z biosintezo v 25 kubičnih fermentorjih z uporabo rekombinantnega mikroorganizma Escherichia coli.

Biosintetična metoda pridobivanja insulina je bila uporabljena v zgodnjih 80. letih

Oglejmo si shemo za proizvodnjo rekombinantnega insulina (Eli Lilli- Eli-Lilly, Združene države Amerike):

Faza 1. S kemično sintezo so nastale nukleotidne sekvence, ki kodirajo tvorbo A in B verig, to je sintetičnih genov.

2. faza. Vsak od sintetičnih genov je uveden v plazmid (gen za sintetiziranje verige A je uveden v en plazmid in genski sintetizirni trak B je uveden v drug plazmid).

3. faza. Vnesite gen, ki kodira tvorbo encima betagalaktozidaze. Ta gen je vključen v vsak plazmid, da bi dosegli močno replikacijo plazmidov.

4. faza. Plazmide vnesemo v celico Escherichia coli - dobimo Escherichia coli in dve kulturi proizvajalcev, ena kultura sintetizira verigo A, drugo B verigo.

5. faza. Dve kulturi postavimo v fermentor. V sredo dodamo galaktozo, ki inducira tvorbo encima betagalaktozidaze. V tem primeru se plazmidi aktivno razmnožujejo in tvorijo veliko kopij plazmidov in s tem veliko genov, ki sintetizirajo A in B verige.

6. faza. Celice lizirajo, izločajo verige A in B, ki so povezane z betagalaktozidazo. Vse to obdelamo s cianogen bromidom in A in B verigami odcepimo od beta galaktozidaze. Nato izvedite nadaljnje čiščenje in izbiro A in B verig.

7. faza. Cisteinski ostanki so oksidirani, vezani in pripravljeni insulin.

Insulin, dobljen na ta način, je človeški insulin v svoji strukturi, ki že od samega začetka zdravljenja zmanjšuje pojav alergijskih reakcij.

Za pridobitev prečiščenega humanega insulina je hibridni protein, izoliran iz biomase, izpostavljen kemijsko-encimski transformaciji in ustreznemu kromatografskemu čiščenju (frontalna, gelsko penetrirajoča, anionska izmenjava).

Na Inštitutu Ruske akademije znanosti smo pridobili rekombinantni inzulin z uporabo gensko spremenjenih sevov E. coli, pri čemer je metoda sestavljena iz sinteze njenega biološkega prekurzorja proinzulina, ki omogoča, da se ne izvede ločena sinteza verig insulina A in B. Za proizvodnjo pro-insulinskega dela molekule v E. coli. uvedemo plazmid (dobimo ga z vstavljanjem naravne ali tuje DNA - tako dobimo rekombinantno molekulo RNA). Plazmid zagotavlja sintezo rekombinantnega proteina, ki je vodilna sekvenca in fragment beljakovine, kot tudi humani proinzulin z metioninskim ostankom (aminokisline) med njimi. Pro-inzulinski del molekule se loči z obdelavo z bromovim cianom v ocetni kislini (cepitev poteka selektivno - z metioninskim ostankom). Zmes (proinzulinski del in vodilna sekvenca) ločimo s kromatografijo. Na naslednji stopnji v nastali sekvenci proinzulina izvedemo pravilno medsebojno razporeditev verig A in B, ki jo opravi osrednji del - peptid C. V naslednji stopnji vezavni C peptid izoliramo z encimatsko metodo. Po seriji kromatografskih čiščenj, vključno z ionsko izmenjavo, gelom in HPLC, dobim človeški inzulin visoke čistosti in naravno aktivnost.

Nadzor kakovosti gensko spremenjenega insulina pomeni nadzor dodatnih indikatorjev, ki označujejo stabilnost rekombinantnega seva in plazmida, odsotnost tujih genskih snovi v pripravku, identiteto izraženega gena itd.

1.2 Pripravki insulina

Pripravki humanega insulina za kemijsko strukturo so popolnoma identični humanemu insulinu.

Pripravki insulina, odvisno od začetka in trajanja delovanja, so razdeljeni v naslednje skupine: t
1) insulini hitrega in ultrakratkega delovanja;
2) kratkodelujoči insulini ("preprosti" insulini);
3) insulini srednjega trajanja (»vmesni« insulini);
4) dolgodelujoči insulini;
5) "mešani" insulini - kombinacija insulinov različnega trajanja.

Število inzulinskih pripravkov z različnimi imeni je več deset, na leto pa se dodajo nova imena insulina iz različnih tujih, v zadnjih letih pa domača farmacevtska podjetja.

Hitri in ultrakratki insulini

Hitri in ultrakratki insulini trenutno vključujejo tri nova zdravila - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) in glulissin (apidra). Njihova posebnost je hitrejši začetek in konec akcije v primerjavi z običajnim, »preprostim« osebnim insulinom. Hitri učinek novih insulinov na znižanje glukoze je posledica njihove pospešene absorpcije iz podkožne maščobe. Posebnosti novih insulinov omogočajo skrajšanje časa med injiciranjem in vnosom hrane, zmanjšanje ravni post-prehranske glikemije in zmanjšanje pojavnosti hipoglikemije.

Začetek delovanja lizpro, aspart in glulisin je v razponu od 5 do 10-15 minut, največji učinek (največji učinek) - po 60 minutah, trajanje delovanja - 3 do 5 ur. Te insuline dajemo 5 do 15 minut pred obrokom ali tik pred njim. Ugotovljeno je bilo, da dajanje insulina lispro takoj po obroku zagotavlja dobro glikemično kontrolo. Pomembno pa je vedeti, da lahko uporaba teh insulinov 20 do 30 minut pred obrokom povzroči hipoglikemijo.

Bolniki, ki preidejo na uvedbo teh insulinov, morajo pogosteje kontrolirati glikemično raven, dokler se ne naučijo povezovati količino porabljenih ogljikovih hidratov in odmerek insulina. Tako so odmerki zdravil določeni v vsakem primeru posebej.

Če je uporabljen samo humalog (Insulin lispro), nov hitri ali novinec (insulin aspart) ali apidra (insulin glulisin), se lahko dajejo 4-6-krat na dan in v kombinaciji z dolgotrajno delujočimi insulini 3-krat na dan. V izjemnih primerih je dovoljen presežek posamezne doze 40 U. Te insuline, ki so na voljo v vialah, lahko v isti brizgi zmešate s pripravki humanega insulina z daljšim trajanjem delovanja. Ko se ta insulin visoke hitrosti najprej zbere v brizgi. Injiciranje je zaželeno narediti takoj po mešanju. Ti insulini, proizvedeni v vložkih (posebni rokavi), niso namenjeni pripravi zmesi s katerim koli drugim insulinom.

To je pomembno!
Novi hitri insulini so primerni za bolnike, ki vodijo aktivni življenjski slog, njihova uporaba je priporočljiva za akutne okužbe, čustveni stres, povečanje količine ogljikovih hidratov v hrani, jemanje zdravil, ki spodbujajo hiperglikemijo (tiroidni hormoni, kortikosteroidi - prednizolon itd.) Z drugimi intolerancami insulinske pripravke ali post-prehransko hiperglikemijo, ki je slabo podvržena delovanju drugih insulinov. Še enkrat je treba poudariti, da je treba hitrodelujoče insuline uporabljati v neposredni povezavi z vnosom hrane.

Tehnologija proizvodnje insulina

Tehnološka shema

Vrste insulina in metode za njegovo proizvodnjo

Predpisi za proizvodnjo gensko spremenjene metode insulina

Domov> Predstavitev> Medicina, zdravje

Tehnologija proizvodnje insulina

Insulin.docx

Preberite Več O Sladkorni Bolezni

Simptomi Diabetesa

Glikemični Indeks