Razvoj in poenotenje metod za analizo in standardizacijo insulinskih pripravkov z reverzno fazno visokotlačno tekočinsko kromatografijo (RP HPLC) Pikhtar Anatolij Vasiljevič

• Diagnostika

V diplomski nalogi je treba v bližnji prihodnosti obiskati knjižnico.
Obvestite o sprejemu

Teza - 480 rubljev., Dostava 10 minut, 24 ur na dan, sedem dni v tednu in prazniki.

Izvleček - 240 rubljev, dostava 1-3 ure, od 10-19 (moskovski čas), razen nedelje

Pihtar Anatolij Vasiljevič. Razvoj in poenotenje metod za analizo in standardizacijo pripravkov insulina z reverzno fazno visokotlačno tekočinsko kromatografijo (RP HPLC): disertacija. Kandidat za farmacevtske vede: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Vasiljevič; [Kraj varstva: Moskovska medicinska akademija].- Moskva, 2005.- 139 str.: Il.

Vsebina disertacije

POGLAVJE 1. Pregled literature 11

1. Vloga insulina pri zdravljenju sladkorne bolezni 11

2. Biosinteza in biološko delovanje insulina 12

3. Splošne značilnosti fizikalno-kemijskih in farmacevtskih lastnosti insulina 15

4. Pripravki insulina 24

5. Proizvodne metode, standardizacija in nadzor kakovosti pripravkov insulina 31

6. Uporaba HPLC pri farmacevtski analizi insulina. 46

POGLAVJE 2. Izjava o težavi 50

POGLAVJE 3. Študija vpliva različnih dejavnikov na kromatografsko obnašanje insulina v pogojih RP HPLC 56

1. Metode in materiali 57

2. Razprava o rezultatih 62

2.1. Vpliv sestave puferske raztopine 62

2.2. Učinek koncentracije natrijevega sulfata 68

2.3. Vpliv temperature kromatografske kolone 70

2.4. Učinek organskega modifikatorja 75

2.5. Vpliv dolžine alkilnega radikala cepljene faze 80

2.6. Vpliv dolžine kromatografske kolone 80

POGLAVJE 4. Izboljšanje farmakopejskih metod za analizo pripravkov insulina, ki temeljijo na uporabi RP HPLC 82

1. Izbira optimalnih pogojev za kromatografsko določanje insulina in njegovih nečistoč v zdravilnih pripravkih 82

2. Metrološke značilnosti metode 84

3. Uporaba razvite metodologije za testiranje uradnih insulinskih pripravkov 95

POGLAVJE 5. Razvoj metod za analizo injekcijskih doznih oblik izofan-insulina na podlagi metode PF HPLC 107 t

1. Izbira pogojev za kromatografsko določanje protamina v dozirnih oblikah izofan-insulina 110

2. Študija kromatografskih profilov protaminov, izoliranih iz različnih vrst rib 121

3. Metoda za določanje protamina v pripravkih izofan-insulina 123

4. Validacija razvite metodologije 125

Splošni sklepi 136

Literatura 139

Splošne značilnosti fizikalno-kemijskih in farmacevtskih lastnosti insulina

S kemičnega vidika je insulin majhen kroglasti protein z molekulsko maso do 6000 Da. Hkrati je treba opozoriti, da je insulin splošno ime za celo družino homolognih beljakovin naravnega in umetnega izvora s skupno značilno biološko aktivnostjo. Proteinska narava insulina je bila ustanovljena leta 1928 [52]. To je med beljakovinami, ki proizvajajo biuretno reakcijo in Paulijevo reakcijo. Struktura insulina je bila v celoti vzpostavljena v zgodnjih 50. letih. Za elementarno kemično sestavo insulinov različnega izvora so značilne številke, navedene v tabeli 1 [40].

Sestava aminokislin. Vecina molekul insulina vsebuje 51 aminokislinskih ostankov, med katerimi je 17 aminokislin, najdenih v vecini znanih proteinov.

Značilna značilnost aminokislinske sestave govejega, prašičjega in humanega insulina je triptofan in metionin. Sestava aminokislin teh vrst insulina je predstavljena v tabeli 2 [40,46].

Vsebnost cistina (6 pol cistinskih ostankov) je nespremenljiva za vse vrste insulina. Poleg tega molekula insulina vseh vrst vsebuje 6 amidnih skupin (asparagin, glutamin).

Ko se insulin spusti, skupaj z glavno frakcijo, lahko opazimo frakcije deamidiranih oblik insulina. V kislem okolju se lahko v procesu deamidacije postopoma odcepi vseh 6 amidnih skupin in elektroforetska in kromatografska mobilnost sprememb insulina [40]. Nastajanje deamidiranih oblik insulina se lahko oceni na podlagi rezultatov določanja amoniaka. Za popolnoma amidno obliko insulina se določi 6 mol amoniaka na 1 mol beljakovin, pri deamidiranih oblikah pa je ta vrednost od 5 do 0.

Primarna struktura insulina. Primarno strukturo insulina je skupina Sanger dešifrirala leta 1945-1955. Z uporabo številnih kromatografskih metod, ki so omogočile ločevanje in identifikacijo različnih peptidov, aminokislin in njihovih derivatov, je Sanger uspel vzpostaviti primarno strukturo govejega insulina [130,131,132,133,134,135]. Nadaljnje študije insulinov različnega izvora z različnimi fizikalno-kemijskimi metodami, vključno z Edmanovo metodo za določanje polnega zaporedja amino kislin v dolgih peptidih, so potrdile ugotovitve Sangerja in njegovih soavtorjev o strukturi insulina [bb].

Do danes je bila primarna struktura insulina določena pri predstavnikih 24 vrst, ki spadajo v 4 razrede živali: sesalcev, ptic, rib in ciklostom [14]. Raziskave o insulinu različnega izvora se nadaljujejo [71,72,73].

Struktura insulina pri različnih živalih je podobna, vendar ne enaka. V svoji primarni strukturi je humani insulin podoben prašičjim psom, psom, kitolovom in kunčjim insulinom, ki se razlikujejo le v eni aminokislini [40]. Od goveda se razlikuje od treh aminokislin. V večji meri človeški insulin ni podoben insulinu gvinejskega prašiča, ptic in rib [40]. Razlike v aminokislinskem zaporedju humanih, prašičjih in govejih insulinov so prikazane v tabeli 3.

Kljub strukturnim razlikam imajo vse vrste insulinov podobno biološko aktivnost, t.j. povzročajo hipoglikemični učinek. Vendar je obseg prikazane biološke aktivnosti močno odvisen od vrste in je v razponu od 11 ie / mg (inzulin iz Severnega morja) do 62 ie / mg (puran in piščančev insulin), medtem ko je aktivnost humanega insulina približno 25-30 ie / mg [40]. Večja kot so razlike med vrstami, večja je razlika v biološki aktivnosti ustreznega insulina.

Funkcionalno aktivna molekula insulina je sestavljena iz dveh polipeptidnih verig (A in B verige), ki sta povezani z disulfidnimi vezmi; eno vez tvorijo sedmi aminokislinski ostanki obeh verig, druga disulfidna vez tvorijo 20. ostanek A-verige in 19. ostanek B-verige (slika 2). Poleg tega je v molekuli insulina tretja disulfidna vez, ki je intrachain in povezuje 6. in 11. ostanke A-verige [59,117].

Sekundarna struktura Z uporabo različnih fizikalno-kemijskih in fizikalnih raziskovalnih metod je bilo dokazano, da ima molekula insulina visoko urejeno prostorsko strukturo (konformacijo), kar prispeva k uresničevanju specifičnih bioloških funkcij [14]. V molekuli nativnega insulina sta hkrati prisotni cc-helix in p-fold listi. Poleg tega obstajajo območja z neurejeno strukturo in strukturo <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Ko se kisla raztopina insulina (pH 2,3-2,5) segreje pri temperaturi +100 ° C in hitro ohladi na -80 ° C, nastane tako imenovani fibrilarni insulin - popolnoma neaktivna oblika hormona [27]. Vnos fibrilarnih vlaken insulina v raztopino aktivnega insulina povzroči spontano kvantitativno obarjanje inzulina v obliki fibrilov [14,17].

Metode proizvodnje, standardizacija in nadzor kakovosti pripravkov insulina

Pridobivanje živalskih vrst insulina. Industrijska proizvodnja govejega in svinjskega insulina je bila ustanovljena skoraj istočasno v številnih državah kmalu po odkritju insulina leta 1921 [63]. Od takrat je koncept pridobivanja insulina ostal skoraj nespremenjen (tabela b) [17, 18]. Surovine za proizvodnjo živalskih vrst insulina so trebušna slinavka klavnega goveda, ki se uporablja za prehrano.

Najpomembnejša naloga pri proizvodnji insulina je njeno čiščenje - sproščanje snovi iz sorodnih nečistoč, ki zmanjšujejo biološko aktivnost, povzročajo imunološke reakcije ali so potencialno nevarne za zdravje bolnika. Na primer, po nekaj letih uporabe slabo prečiščenega insulina v krvi pacienta lahko obstaja do 5.000 ie insulina, vezanega na protitelesa. Protitelesa proti insulinu pomembno vplivajo na profil njegovega delovanja in s tem prispevajo k labilnemu poteku sladkorne bolezni.

Prva metoda čiščenja insulina je bila rekristalizirana v prisotnosti cinkovih soli. Leta 1945 je bilo dokazano, da sedemkratna prekristalizacija insulina bistveno zmanjša raven alergijskih reakcij pri bolnikih v primerjavi z uradnimi insulini v tistem času [63].

Heterogenost vzorcev insulina po kristalizaciji in enkratni prekristalizaciji je prikazana z različnimi metodami: protitočna ekstrakcija (PE), distribucijska kromatografija (PX), ionska izmenjalna kromatografija (IOC), diskelektroforeza (DEP) in gelska izključitvena kromatografija (GEC) [63]..

Ugotovljeno je bilo, da so glavne spremljajoče nečistote insulina: proinzulin, njegovi intermediati, kovalentni dimer insulina, mono-disamido inzulin, monoarginin in mono-etilen, kot tudi številne visokomolekularne spojine, ki niso insulinske narave. Splošni zaključek rezultatov študij, ki so upoštevali informacije o imunološki aktivnosti zaznanih nečistoč [138], je bil zaključek o potrebi po dodatnem čiščenju insulinskih snovi, tako da je pri analizi z metodami DEF in GEC ugotovljena ena komponenta - ustrezni insulin.

Za rešitev problema čiščenja insulina leta 1950 je bila predlagana metoda HEC, leta 1970 pa metoda anionske izmenjevalne kromatografije (AOX). Ugotovljeno je bilo, da insulin, prečiščen z metodo AOX, vsebuje približno 500 ppm (delov na milijon) nečistoč s proinzulinsko aktivnostjo [137]. Dodatno čiščenje inzulina z uporabo visokotlačne tekočinske kromatografije na obrnjenih fazah (RP HPLC) zmanjša vsebnost imunogenih frakcij na mejo njihove detekcije [63].

Pregled trenutnega razvoja na področju kromatografskega čiščenja insulina je predstavljen v [96]. Insulin, prečiščen zaporedoma z uporabo IOC in GEC, se imenuje monokomponentni insulin [63]. Pridobivanje humanega insulina. Iskanje metod za pridobivanje humanega insulina je bilo posledica dveh okoliščin. Po eni strani je nujnost problema surovine v primeru proizvodnje živalskega insulina po drugi strani hiter razvoj znanosti na tem področju zagotovila resnično priložnost za uresničitev ideje. Leta 1979 in 1981 skoraj sočasno sta bili razviti dve metodi pridobivanja humanega insulina - biosintetični in polsintetični [102,108]. Leta 1981 je podjetje Novo Nordisk prvič na svetu začelo serijsko proizvodnjo humanega polsintetičnega insulina. Metoda, ki jo je uporabila družba, temelji na encimski in kemijski zamenjavi Al v molekuli prašičjega inzulina z ostankom Tre [61]. Ta metoda je neposredno odvisna od pridobivanja potrebne količine svinjskega insulina, kar zmanjšuje njegovo ekonomsko vrednost. Možnost pridobivanja humanega insulina z biosintetično metodo se je pojavila z razvojem tehnologije rekombinantne DNA [10]. Dela o proizvodnji gensko spremenjenega insulina so se začela pred približno 25 leti. Leta 1978 so poročali, da je bil dobljen sev proinsou-ling za podgano produkcijo E. coli. Leta 1979 so Genentechove študije uspele klonirati v E. coli gene, ki kodirajo aminokislinske sekvence za. inzulinske verige A in B, vključene v p-halo-tacidazno regijo plazmida pBR322 [10,102]. Leta 1981 je bil sintetiziran proinzulinski gen-analog mini-C-proinzulina, v katerem je bil 35-členski C-peptid nadomeščen s segmentom šestih aminokislin: arg-arg-gly-ser-lys-arg in njegova ekspresija v E. coli. Leta 1982 je Eli Lilly začel s prvo industrijsko proizvodnjo človeškega insulina na svetu z uporabo dveh verižnih tehnologij, razvitih v sodelovanju z Genentechom [102]. Trenutno je bila prikazana možnost pridobivanja humanega insulina s pomočjo različnih ekspresijskih sistemov [3,10,101,102]. Z gospodarskega vidika je zlasti zanimiva uporaba gensko spremenjenih sevov gram-pozitivnih bakterij E.coli, od katerih se mnogi obravnavajo kot prekomerni pridelovalci [3]. Istočasno je bil pomemben napredek dosežen s celicami kvasovk Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabela 7 navaja glavne, skupne za različne metode proizvodnje rekombinantnega humanega insulina, faze tehnološkega procesa [3,10,63].

Uporaba razvite metodologije za testiranje uradnih insulinskih pripravkov

Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC) je različica tekočinske kromatografije, pri kateri mobilna faza - eluent - prehaja skozi sorbent, ki napolni kolono pri visoki hitrosti zaradi velikega pritiska (do 400x105 Pa) na vhodu v kolono [11].

Za analizo kompleksnih zmesi snovi se je HPLC pojavil pred nekaj več kot 30 leti. Uporaba sorbentov s premerom delcev 3–10 μm je povzročila močno povečanje učinkovitosti kromatografskega ločevanja v primerjavi s klasično različico kolonske tekočinske kromatografije. Zato se HPLC pogosto imenuje tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC). Instrumentalne značilnosti uporabe HPLC so podrobno opisane v številnih priročnikih [49,50] in v ustreznih oddelkih vodilne farmakopeje [79,150]. Za HPLC je bil razvit širok spekter sorbentov in se proizvaja. Po mnenju avtorjev raziskave [51] - okoli 100 podjetij po svetu proizvede več kot 300 vrst sorbentnih imen. Zgodovina, trenutno stanje in perspektive razvoja metode so obravnavane v pregledih [51] in [77.78].

Pri različnih variantah se metoda HPLC široko uporablja v farmacevtski analizi (kontrola proizvodnje in testiranje kakovosti zdravil). Metoda je vključena v vse vodilne farmakopeje na svetu. Ta metoda je najbolj opisana v evropski in ameriški farmakopeji. HPLC se uporablja za identifikacijo zdravil, za določitev čistosti, frakcijsko sestavo molekulske mase in kvantitativno analizo. V US Pharmacopoeia 28 ed. približno 30% zasebnih izdelkov vključuje uporabo HPLC. V Evropski farmakopeji 4. izd. ta številka je približno 40%.

Prva kromatografska metoda za testiranje insulina je bila nizkotlačna gelska izključitvena tekočinska kromatografija (GE ZhND). Načelo ločevanja pod pogoji HPLC temelji na različni sposobnosti molekul različnih velikosti, da prodrejo v pore nevtralnega gela, ki služi kot stacionarna faza. Hidrodinamični premer insulinskega monomera in dimera je sorazmeren z njihovo molekulsko maso in znaša 2,69 oziroma 5,50 nm [115].

Leta 1967 je bilo po metodi GE-IHDD pokazano, da komercialni pripravki insulina, prečiščeni s kristalizacijo, vsebujejo nečistoče z molekulsko maso, ki presega molekulsko maso insulina [63]. Na kromatogramu prašičjega inzulina so našli tri vrhove, ki so običajno označeni kot a-, b- in c-komponente. Od takrat je bilo predlaganih več kromatografskih sistemov za nadzor vsebnosti nečistoč z visoko molekulsko maso v insulinih. Ločitev smo izvedli na visoko nabrekajočih agaroznih kserogelih (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Ali dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M raztopine ocetne kisline uporabili kot IF [127]. Zaradi visoke občutljivosti teh sorbentov na stiskanje pri tlakih, ki presegajo tlak nabrekanja matrice, so ti materiali neprimerni za delovanje v načinu HPLC.

Uporaba gel-izključitvene tekočinske kromatografije pri visokih tlakih (GE HPLC) za analizo insulina je bila prvič opisana leta 1980, po razvoju trdih makroporoznih sorbentov, združljivih z vodo, in odpornih na visoke pritiske. V [151] je bila ločitev izvedena na kolonah Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) v pogojih denaturacije (kombinacija 7 M raztopine sečnine, mineralnih kislin in neionskih snovi) detergenti). Potreba po analizi insulina v denaturacijskih pogojih je povezana s sposobnostjo inzulina, da se agregira v raztopini. Za ločevanje insulina v pogojih HPLC HPLC je bila opisana tudi uporaba "tradicionalne" eluentne ocetne kisline [152]. Uporaba ocetne kisline ima več prednosti - minimalen vpliv na nativno strukturo ločenih spojin, razpoložljivost, nizki stroški, poleg tega je pomembno dejstvo, da ocetna kislina zavira povezavo insulina.

Trenutno je HPLC ghvd farmakopejska metoda za spremljanje vsebnosti nečistoč z visoko molekulsko maso v snoveh in končnih oblikah. Metoda se uporablja tudi za določanje vsebnosti protamina v preparatih izofanskega insulina.

Uporaba HPLC na reverznih fazah (RP HPLC) za ločevanje goveda in prašičjega inzulina je prvič pokazala visoko učinkovitost te metode za analizo insulinu podobnih peptidov s podobno strukturo.

Mehanizem ločevanja proteinov in polipeptidov v pogojih RP HPLC temelji na različni hidrofobnosti molekul insulina in sorodnih nečistoč. Doslej je bilo opisanih več deset metod za kromatografsko ločevanje insulina različnega izvora in njihovih derivatov, vključno s proin-sulinom, pankreatičnimi polipeptidi, dezamido derivati, insulinski dimer. [126] je pokazala možnost ločevanja piščančjega, kunčjega, ovčjega in konjskega insulina. Ločili smo tudi človeški, goveji in svinjski insulin. Lloyd in Corran sta objavila metodo za ločevanje govedine, svinjine, človeških insulinov in njihovih ustreznih deamidiranih oblik [104].

Ločevanje poteka na silikagelnih sorbentih z modificiranimi, metilnimi, butilnimi, oktilnimi, oktadecilnimi in fenilnimi skupinami v izokratskem ali gradientnem načinu. Kot PF se uporabljajo organski modifikatorji - acetonitril, metilni alkohol, izopropilni alkohol, pomešani z vodnimi pufernimi raztopinami, ki vsebujejo anorganske soli in ionske parne reagente. Detekcija vrha se izvaja predvsem s spektrofotometrično metodo pri valovni dolžini 190-220 nm, opisane so tudi fluorimetrične metode [103].

Analiza snovi in ​​končnih doznih oblik insulina z uporabo RP HPLC je opisana v zasebnih člankih v ameriški in evropski farmakopeji [79,150]. Metoda se uporablja za testiranje zdravil določene skupine v smislu "pristnosti insulina", "sorodnih beljakovin", "kvantitativne določitve" in "raztopine insulina".

Raziskovalna literatura opisuje tudi uporabo ionske izmenjave in afinitetne kromatografije za analizo insulina [44,102], vendar te metode v farmakopejski praksi niso široko uporabljene.

Izbira pogojev za kromatografsko določanje protamina v dozirnih oblikah izofan-insulina

Povečanje ionske jakosti PF običajno vodi do povečanja razmerij kapacitete insulina, kar lahko povzroči več dejavnikov: - povečanje koncentracije ionov zmanjša stopnjo ionizacije nabitih skupin proteinske molekule, povečanje njene hidrofobnosti / - visoka koncentracija kationov prispeva k presejanju prostih silanolnih skupin na stacionarni površini. faza, ki oslabi nespecifično elektrostatično interakcijo protoniranih amino skupin proteina z matriksom; - visoka ionska moč vpliva na prostorsko strukturo insulina, zaradi česar se spremeni površina, ki je v interakciji s sorbentom. Koncentracija anorganskih soli v FS vpliva na obliko vrhov in selektivnost ločevanja insulina in desamido-Asn-insulina [143,144]. Z izokratskim eluiranjem na sorbentu LiChrosorb Sív z 0,1 M raztopino natrijevega fosfata (pH 2,3) je bil dosežen zadovoljiv rezultat le, ko je bil pufrski raztopini dodan natrijev sulfat do koncentracije 0,1 M. Večina metod za analizo insulina, vključenih v farmakopejske izdelke in ND PF uporabimo na osnovi pufernih raztopin z vsebnostjo natrijevega sulfata 0,2 M. Takšna visoka vsebnost natrijevega sulfata negativno vpliva na ponovljivost rezultatov kromatografije zaradi stratifikacije eluentov, poleg tega pa visoko koncentrirane raztopine soli negativno vplivajo na kromatografsko opremo in skrajšajo njeno življenjsko dobo. Glede na to, da so bile farmakopejske metode analize razvite pred več kot 20 leti, je bilo zanimivo preučiti kromatografsko obnašanje insulina pod OF-HPLC na kromatografskih sorbentih zadnje generacije, odvisno od koncentracije natrijevega sulfata. Hkrati so skušali ugotoviti, ali je zmanjšanje vsebnosti natrijevega sulfata v PF dovoljeno brez znatnega poslabšanja sposobnosti ločevanja kromatografskega sistema. Kot rezultat raziskave je bilo ugotovljeno, da je učinek koncentracije natrijevega sulfata v PF različen, odvisno od vrste cepljene faze, pa tudi od vrste insulina. Na sorbentih s cepljenimi skupinami C4 in C selektivnost ločevanja vrhov humanega insulina in desamido-Asn humanega insulina ni odvisna od koncentracije natrijevega sulfata v. raztopina puferja 1 v območju od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbentu Diaspher-110-C18 ima ločilna selektivnost tega para vrhov največje vrednosti pri 0,05 M in najmanj pri 0,1 M (diagram 4). Po drugi strani pa selektivnost ločevanja živalskih vrst inzulina in njihovih ustreznih desamidiranih oblik AsnA21 ni odvisna od ionske jakosti raztopine, ko je ločena na sorbentu Diasphere-110-C18. Na sorbentu s C8 cepljenimi skupinami se selektivnost poveča z 1,25 na 1,28 s povečanjem koncentracije natrijevega sulfata (slika 4). Na sorbentu s C4 cepljenimi skupinami je selektivnost ločevanja v primeru govejega insulina največja pri 0,1 M natrijevega sulfata in minimalna na 0,2 M. Za svinjski insulin ni izrazitega maksimuma pri koncentraciji natrijevega sulfata 0,1 M, v tem primeru povečanje ionskega sile so povzročile zmanjšanje selektivnosti ločevanja (slika 4). Število učinkovitih teoretičnih plošč se povečuje s povečanjem koncentracije natrijevega sulfata. Izjema je obnašanje humanega insulina na sorbentu Diasfer-110-C8 (slika 5). Stopnja ločenosti vrhov insulina in desamido-Asn-inzulina narašča s povečanjem ionske jakosti FS, ne glede na vrsto insulina in vrsto cepljene faze (diagram b). Z zmanjšanjem koncentracije natrijevega sulfata z 0,2 M na 0,1 M se stopnja ločitve izbranega para vrhov v povprečju zmanjša za 5% za humane in prašičje insuline in za 10% za goveji insulin. Ob upoštevanju dejstva, da absolutna vrednost stopnje ločenosti presega 2,0, merjeno poslabšanje ločilne zmogljivosti kolone po našem mnenju ni pomembno. Posledično lahko koncentracijo natrijevega sulfata v pufrski raztopini PF zmanjšamo 2-krat v primerjavi s farmakopejskimi metodami analize.

V večini študij o analizi proteinov in peptidov se ločevanje izvaja pri sobni temperaturi. Poleg tega nekateri avtorji kažejo, da je učinek temperature na selektivnost ločevanja minimalen [48]. Z naraščanjem temperature pa se pospeši proces masovne izmenjave med stacionarnimi in mobilnimi fazami, kar vodi do zmanjšanja retencijskega časa peptidov in zmanjšanja vrhov.

Insulin je standardiziran z

Trebušna slinavka je eden najpomembnejših organov z dvojnim izločanjem - notranji in zunanji.
Produkt notranje sekrecije je insulin, ki igra pomembno vlogo pri presnovi ogljikovih hidratov. Insulin je produkt posebne vrste celic, ki so združene v tako imenovane »Langerhansove otoke«.

Zunanja skrivnost je pankreasni sok, ki vsebuje tripsin - enega najpomembnejših prebavnih encimov, ki ga izločajo žleze, ki tvorijo glavno maso trebušne slinavke. Tripsin je glavni del pripravka pankreatina.
Insulin (Insulinum). Insulin je bil v svoji čisti obliki izoliran leta 1921. Za njegovo izdelavo je veliko načinov, ki se med seboj razlikujejo večinoma le podrobno.

Ker je encim tripsin poleg insulina v trebušni slinavki, ki z lahkoto lomi inzulin, prvi poskusi pridobivanja insulina iz trebušne slinavke niso uspeli. Zato smo ga poskušali pridobiti iz žleze, v kateri bi bil ta encim odsoten, na primer iz žlez rib ali intrauterinih telet. Toda tudi ti poskusi proizvodnega uspeha niso imeli, saj je v ribah velikost žleze zelo majhna in je tehnično težko izolirati samo žlezo; Ekstrakcija žlez znotraj maternice v velikih količinah za proizvodnjo predstavlja precejšnje težave.
Nazadnje so leta 1922 poskusi z žlezo zrelega goveda pokazali, da so encimi (tripsin, itd.) Pri uporabi nakisanega močnega alkohola inaktivirani in izgubijo sposobnost uničenja insulina.

Tehnološka shema proizvodnje. Za proizvodnjo insulina se uporablja zamrznjena ali sveža trebušna slinavka predvsem iz goveda in prašičev.
Drobljenje. Da bi se izognili uničenju hormona s tripsinom, je treba sveže žleze najkasneje 30 minut po zakolu živali očistiti iz sosednjih tkiv, zdrobimo v mesarju.

Ekstrakcija Zdrobljene žleze vlijemo s 95% alkoholom, nakisamo z žveplovo kislino (1 del žleze je 1,5 dele alkohola 95 ° brez aldehidov + 0,5% žveplene ali klorovodikove kisline). Zmes ekstrahiramo s hlajenjem 1,5 ure in neprestano mešamo.
Prvi ekstrakt odcedimo, ostanek izrežemo ali centrifugiramo. Ekstrakcija se ponovno ekstrahira z 1 uro 60 ° alkohola (in ne 95 °, ker v surovini ni vlage) - en del žleze vzame en del alkohola. Oba ekstrakta se izčrpata skupaj in filtrirana skozi pločevino.

Odstranjevanje balastnih beljakovin. Iz pridobljenega ekstrakta se beljakovine odstranijo na različne načine:
1) z usedanjem v mrazu (od –4 do 0 ° C) v 48 urah.
2) ekstraktu dodamo raztopino natrijevega hidroksida do pH 6,6 - 6,8 (v nekaterih primerih - do pH = 6,4 - 6,6).

Precipitacijo ločimo s centrifugiranjem, filtracijo ali sedimentacijo.
Izhlapevanje in razmaščevanje. Nastala bistra tekočina je nakisana s čisto žveplovo kislino do pH = 2,5 in je izpostavljena uparjenju do 1/10 volumna pri temperaturi, ki ni višja od 40 ° C.
Po odstranitvi vsega alkohola se tekočina razmaši.

Soljenje in čiščenje. Amonijevemu sulfatu dodamo razmaščenemu filtratu do nasičenja, po katerem se pojavi insulin z majhno količino balastnih snovi, ki tvorijo skorjo surovega inzulina, ki jo odstranimo in posušimo ter nato razmaščimo z mešanico alkohola in etra.
Razmaščeni insulin se posuši v pogojih okolja in zmleti v prah. Prašek iz cvetenja podvržemo nadaljnjemu čiščenju, da dobimo kristalni insulin, ki vsebuje vsaj 22 U v 1 mg.
Standardizacija. Nastali insulin je bel ali rahlo sivkast prašek. Topen je v vodi in v vodni raztopini alkohola do 80 °, vendar je v alkoholu netopen, trdnjava nad 90 °. Ko se insulin raztopi v vodi, dobimo bodisi brezbarvno ali rahlo rumenkasto tekočino.

Za konzerviranje raztopini dodamo 0,3% trikresola ali fenola in izpostavimo biološki standardizaciji. Ko se insulin injicira v kunce, se mora njihova vsebnost ogljikovih hidratov v krvi 1,5–5 ur v povprečju zmanjšati za 50%, tj. Od 0,09 do 0,045% (glej Farmakopeja, 9. izdaja). Ustrezni odmerek se imenuje ena kunčja enota, ki je enaka trimu človeku ali treh kliničnim.
Embalaža Raztopino spustimo skozi bakterijski filter. Filtrat se nato v aseptičnem stanju vlije v steklenice po 5 ali 10 ml v vsakem mililitru raztopine insulina, ki vsebuje 40 ali 80 U.

Viale zapremo z gumijastimi zamaški, ki so obloženi z aluminijastimi pokrovčki.
Na steklenice in na škatlo s steklenicami se nalepijo etikete, na katerih je treba navesti pripravo, datum izdelave, rok uporabnosti itd.

Pred uporabo insulina odprete aluminijasto zaporko, obrišite z alkoholom, zamašite plutovinasto iglo s sterilno iglo in v brizgo vstavite potrebno količino tekočine, ki se injicira subkutano ali intramuskularno.
Shranjevanje Insulin je shranjen v vialah. Rok uporabnosti je 18 mesecev pri temperaturi, ki ni višja od 10 ° C, saj lahko pri višji temperaturi insulin delno izgubi aktivnost.

Zunanji znaki neprimernosti: zamegljenost raztopine ali padavin, pojav plesni znotraj vial ali kolonij mikroorganizmov.

Farmakološka skupina - insulini

Pripravki podskupin so izključeni. Omogoči

Opis

Insulin (iz latinščine Insula - otoček) je protein-peptidni hormon, ki ga proizvajajo β-celice Langerhansovih otočkov pankreasa. V fizioloških pogojih nastane beta-celični insulin iz preproinzulina, enoverižnega prekurzorskega proteina, ki sestoji iz 110 aminokislinskih ostankov. Po prenosu grobega endoplazmičnega retikuluma skozi membrano se od preproinzulina in proinzulina oblikuje signalni peptid s 24 aminokislinami. Dolga veriga proinzulina v Golgijevem aparatu je pakirana v granule, kjer se zaradi hidrolize ločijo štirje glavni aminokislinski ostanki, da nastanejo inzulin in C-terminalni peptid (fiziološka funkcija C-peptida je neznana).

Molekula insulina je sestavljena iz dveh polipeptidnih verig. Eden od njih vsebuje 21 aminokislinskih ostankov (veriga A), drugi - 30 aminokislinskih ostankov (veriga B). Verige so povezane z dvema disulfidnima mostovoma. Tretji disulfidni most se tvori znotraj verige A. Celotna molekulska masa molekule insulina je okoli 5700. Aminokislinsko zaporedje insulina velja za konzervativno. Večina vrst ima en inzulinski gen, ki kodira en protein. Izjema so podgane in miši (imajo dva insulinska gena), proizvajajo dva insulina, ki se razlikujeta v dveh aminokislinskih ostankih B-verige.

Primarna struktura insulina v različnih bioloških vrstah, vklj. in pri različnih sesalcih, nekoliko drugače. Najbližje strukturi humanega insulina je prašičji insulin, ki se od človeškega razlikuje od aminokisline (ima alaninski ostanek v verigi B namesto aminokislinskega ostanka treonina). Goveji insulin se razlikuje od treh aminokislinskih ostankov pri ljudeh.

Zgodovinsko ozadje. Leta 1921 sta Frederick G. Banting in Charles G. Best, ki sta delala v laboratoriju Johna J. R. McLeoda na Univerzi v Torontu, pridobila izvleček iz trebušne slinavke (kot se je kasneje izkazalo, da vsebuje amorfni insulin), kar je znižalo raven glukoze v krvi pri psih. z eksperimentalnim diabetesom. Leta 1922 je bil prvi bolnik, 14-letni Leonard Thompson, ki ima sladkorno bolezen, injiciran ekstrakt trebušne slinavke in mu je tako rešil življenje. Leta 1923 je James B. Collip razvil metodo za čiščenje ekstrakta, izločenega iz trebušne slinavke, ki je kasneje omogočil pripravo aktivnih izvlečkov iz trebušne slinavke prašičev in goveda, ki dajejo ponovljive rezultate. Leta 1923 sta Banting in McLeod prejela Nobelovo nagrado za fiziologijo in medicino za odkritje insulina. Leta 1926 sta J. Abel in V. Du-Vigno dobila insulin v kristalni obliki. Leta 1939 je insulin prvič odobril FDA (Food and Drug Administration). Frederick Sanger je popolnoma dešifriral aminokislinsko zaporedje insulina (1949–1954), leta 1958 pa je Sangerju podelil Nobelovo nagrado za delo pri dešifriranju strukture proteinov, zlasti insulina. Leta 1963 je bil sintetiziran umetni inzulin. Prvi rekombinantni humani insulin je FDA odobrila leta 1982. FDA je odobrila analog ultrazvočnega insulina (lispro insulin) leta 1996.

Mehanizem delovanja. Pri izvajanju učinkov insulina ima vodilno vlogo njegova interakcija s specifičnimi receptorji, lokaliziranimi na plazemski membrani celice, in tvorbo insulin-receptorskega kompleksa. V kombinaciji z insulinskim receptorjem insulin vstopi v celico, kjer vpliva na fosforilacijo celičnih proteinov in sproži številne znotrajcelične reakcije.

Pri sesalcih se insulinski receptorji nahajajo na skoraj vseh celicah, tako na klasičnih ciljnih celicah insulina (hepatociti, miociti, lipociti) kot na krvnih celicah, možganih in spolnih žlezah. Število receptorjev na različnih celicah se giblje od 40 (eritrocitov) do 300 tisoč (hepatociti in lipociti). Insulinski receptor se stalno sintetizira in razgradi, razpolovna doba je 7-12 ur.

Inzulinski receptor je velik transmembranski glikoprotein, ki ga sestavljajo dve a-podenoti z molekulsko maso 135 kDa (vsaka vsebuje 719 ali 731 aminokislinskih ostankov, odvisno od spajanja mRNA) in dve β-podenoti z molekulsko maso 95 kDa (620 aminokislinskih ostankov). Podenote so med seboj povezane z disulfidnimi vezmi in tvorijo heterotetramerično strukturo β-α-α-β. Alfa podenote so locirane zunaj celice in vsebujejo mesta, ki se vežejo na insulin, ki so del receptorja za prepoznavanje. Beta podenote tvorijo transmembransko domeno, imajo aktivnost tirozin kinaze in izvajajo funkcijo pretvorbe signala. Vezava insulina na a-podenoto insulinskega receptorja vodi do stimulacije tirozin-kinazne aktivnosti β-podenot z avtofosforiliranjem njihovih tirozinskih ostankov, pride do agregacije α, β-heterodimerjev in hitre internalizacije hormonskih receptorskih kompleksov. Aktivirani insulinski receptor začne kaskado biokemičnih reakcij, vključno z. fosforilacijo drugih proteinov v celici. Prva od teh reakcij je fosforilacija štirih beljakovin, imenovanih substrati za insulinske receptorje (insulinski receptorski substrat), IRS-1, IRS-2, IRS-3 in IRS-4.

Farmakološki učinki insulina. Insulin vpliva na skoraj vse organe in tkiva. Njegovi glavni cilji pa so jetra, mišice in maščobno tkivo.

Endogeni insulin je najpomembnejši regulator presnove ogljikovih hidratov, eksogeni insulin je specifično sredstvo za redukcijo sladkorja. Učinek insulina na presnovo ogljikovih hidratov je posledica dejstva, da poveča transport glukoze skozi celično membrano in njeno uporabo v tkivih, prispeva k pretvorbi glukoze v glikogen v jetrih. Inzulin poleg tega zavira endogeno produkcijo glukoze z zaviranjem glikogenolize (razgradnjo glikogena na glukozo) in glukoneogeneze (sinteza glukoze iz virov brez ogljikovih hidratov - na primer iz aminokislin, maščobnih kislin). Poleg hipoglikemije ima insulin številne druge učinke.

Učinek insulina na presnovo maščobe se kaže v inhibiciji lipolize, kar vodi v zmanjšanje pretoka prostih maščobnih kislin v krvni obtok. Insulin preprečuje nastanek ketonskih teles v telesu. Insulin poveča sintezo maščobnih kislin in njihovo naknadno esterifikacijo.

Insulin je vključen v presnovo beljakovin: poveča transport aminokislin po celični membrani, stimulira sintezo peptidov, zmanjša uživanje beljakovin v tkivih in zavira pretvorbo aminokislin v keto kisline.

Delovanje insulina spremlja aktivacija ali inhibicija številnih encimov: stimulirajo glikogen sintetazo, piruvat dehidrogenazo, heksokinazo, inhibirajo lipaze (in hidrolizo maščobnih lipidov in lipoprotein lipazo, ki po zaužitju živil z visoko vsebnostjo maščob zmanjšajo motnost seruma).

Pri fiziološki regulaciji biosinteze in izločanju insulina s trebušno slinavko ima koncentracija glukoze v krvi pomembno vlogo: s povečanjem vsebnosti se izločanje insulina poveča in z zmanjšanjem upočasni. Na izločanje insulina poleg glukoze vplivajo elektroliti (zlasti ioni Ca 2+), aminokisline (vključno z levcinom in argininom), glukagon, somatostatin.

Farmakokinetika. Inzulinski pripravki se injicirajo s / c, intramuskularno ali intravensko (v / v, dajemo le kratkodelujoči insulini in samo pri diabetični precomi in komi). V in / ali insulinske suspenzije ni mogoče vstopiti. Temperatura insulina mora biti pri sobni temperaturi hladni insulin se absorbira počasneje. Najbolj optimalen način za kontinuirano zdravljenje z insulinom v klinični praksi je sc.

Popolnost absorpcije in pojav insulinskega učinka sta odvisna od mesta injiciranja (običajno se insulin injicira v trebuh, stegna, zadnjico, nadlaket), odmerek (volumen inzulina), koncentracija insulina v pripravku itd.

Stopnja absorpcije insulina v kri iz mesta injiciranja je odvisna od številnih dejavnikov - kot so insulin, mesto injiciranja, lokalni pretok krvi, lokalna mišična aktivnost, količina injiciranega insulina (za injiciranje na eno mesto ni priporočeno več kot 12–16 U zdravila). Največkrat, insulin vstopi v kri iz podkožnega tkiva sprednje trebušne stene, počasneje od ramena, sprednje površine stegna in še počasneje od subkapularne in zadnjice. To je posledica stopnje vaskularizacije podkožnega maščobnega tkiva na navedenih področjih. Profil delovanja insulina je podvržen znatnim nihanjem pri različnih ljudeh in pri isti osebi.

Inzulin se v krvi veže na alfa in beta globuline, običajno 5-25%, vendar se lahko vezava med zdravljenjem poveča zaradi nastanka serumskih protiteles (nastajanje protiteles proti eksogenom insulinu povzroči odpornost proti insulinu; z uporabo sodobnih visoko prečiščenih pripravkov se redko pojavi odpornost proti insulinu; ). T_1/2 krvi manj kot 10 min. Večina insulina, ki se sprošča v krvni obtok, je podvržen proteolitični razgradnji jeter in ledvic. Hitro se izloča preko ledvic (60%) in jeter (40%); manj kot 1,5% se izloči z urinom v nespremenjeni obliki.

Pripravki insulina, ki se trenutno uporabljajo, se med seboj razlikujejo, med drugim tudi na različne načine glede na izvor izvora, trajanje delovanja, pH raztopine (kislo in nevtralno), prisotnost konzervansov (fenol, krezol, fenol-krezol, metil paraben), koncentracija insulina - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Razvrstitev. Insulini so običajno razvrščeni po poreklu (govedo, prašiči, človeški in analogni humani insulin) in trajanje delovanja.

Odvisno od virov proizvodnje se razlikujejo insulini živalskega izvora (predvsem pripravki iz svinjskega insulina), polsintetični pripravki humanega insulina (pridobljeni iz svinjskega insulina z encimatsko transformacijo), pripravki humanega inzulina (DNA-rekombinant, proizveden z genskim inženiringom).

Za medicinsko uporabo je bil insulin predhodno pridobljen predvsem iz trebušne slinavke goveda, nato iz trebušne slinavke prašičev, saj je prašičji insulin bližje človeškemu insulinu. Ker goveji insulin, ki se razlikuje od treh aminokislin v človeškem telesu, pogosto povzroča alergijske reakcije, ga danes praktično ne uporabljamo. Prašičji insulin, ki se od človeške razlikuje od ene amino kisline, manj verjetno povzroča alergijske reakcije. V insulinskih zdravilih, če ni dovolj čiščenja, so lahko prisotne nečistoče (proinzulin, glukagon, somatostatin, proteini, polipeptidi), ki lahko povzročijo različne neželene učinke. Sodobne tehnologije omogočajo pridobivanje prečiščenega (mono-vrh-kromatografsko prečiščenega z sproščanjem "vrha" insulina), visoko prečiščenih (monokomponentnih) in kristaliziranih pripravkov insulina. Od pripravkov insulina živalskega izvora se daje prednost monolitnemu insulinu, pridobljenemu iz trebušne slinavke prašičev. Insulin, pridobljen z genskim inženiringom, je popolnoma skladen z aminokislinsko sestavo humanega insulina.

Aktivnost insulina se določi z biološko metodo (glede na sposobnost znižanja glukoze v krvi pri kuncih) ali s fizikalno-kemijsko metodo (z elektroforezo na papirju ali s kromatografijo na papirju). Za eno enoto delovanja ali mednarodno enoto jemljete aktivnost 0,04082 mg kristaliničnega insulina. Človeška trebušna slinavka vsebuje do 8 mg insulina (približno 200 U).

Pripravki insulina so razdeljeni na kratke in ultra-kratke droge - posnemajo normalno fiziološko izločanje insulina s trebušno slinavko kot odziv na stimulacijo, zdravila s povprečnim trajanjem in dolgodelujoča zdravila - posnemajo bazalno (ozadje) izločanje insulina in tudi kombinirana zdravila (združujejo obe aktivnosti)..

Obstajajo naslednje skupine:

Ultrshort-delujoči insulini (hipoglikemični učinek se razvije 10–20 minut po s / c dajanju, vrh delovanja dosežemo v povprečju po 1-3 urah, trajanje delovanja pa je 3-5 ur):

- insulin lispro (Humalog);

- insulina aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- insulin glulisin (apidra).

Kratkodelujoči insulini (začetek delovanja ponavadi po 30–60 minutah; maksimalno delovanje po 2–4 urah; trajanje delovanja do 6–8 ur): t

- topni insulin [človeški genski inženiring] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Redno);

- topni insulin [humani polsintetični] (Biogulin R, Humodar R);

- topni insulin [monokomponenta prašiča] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Dolgo delujoči pripravki insulina - vključujejo zdravila s povprečnim trajanjem delovanja in dolgo delujoča zdravila.

Insulini srednjega trajanja delovanja (nastop po 1,5–2 h; vrh po 3–12 urah; trajanje 8–12 h): t

- Inzulin-izofan [človeški genski inženiring] (biosulin N, gansulin N, gensulin N, insuman Bazal GT, insuran NPH, protafan NM, Rinsulin NPH, humulinski NPH);

- insulin-izofan [humani polsintetični] (Biogulin N, Humodar B);

- insulin-izofan [monokomponenta prašiča] (monodar B, Protafan MS);

- suspenzije insulinske cinkove spojine (Monotard MS).

Dolgotrajno delujoči insulini (nastop po 4–8 urah; vrh po 8–18 urah; skupno trajanje 20–30 h): t

- insulin glargin (Lantus);

- insulin detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Kombinirani pripravki insulina (dvofazni pripravki) (hipoglikemični učinek se začne 30 minut po dajanju s / c, doseže maksimum po 2–8 urah in traja do 18–20 ur):

- dvofazni insulin [humani polsintetični] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- dvofazni insulin [gensko spremenjen človek] (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- dvofazni insulin aspart (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Ultrshort-delujoči insulini so analogi humanega insulina. Znano je, da so endogeni insulin v β-celicah trebušne slinavke, kot tudi hormonske molekule v nastalih raztopinah kratkodelujočega insulina, polimerizirane in so heksameri. Ko se s / c dajanje heksamerne oblike absorbira počasi in je najvišja koncentracija hormona v krvi, podobno kot pri zdravi osebi po jedi, nemogoče ustvariti. Prvi kratkodelujoči insulinski analog, ki se absorbira iz podkožnega tkiva 3-krat hitreje kot humani insulin, je bil lispro insulin. Insulin lispro je derivat humanega insulina, dobljen z izmenjavo dveh aminokislinskih ostankov v molekuli insulina (lizin in prolin na položajih 28 in 29 v B-verigi). Spreminjanje molekule insulina moti nastajanje heksamerjev in zagotavlja hiter pretok zdravila v kri. Skoraj takoj po vbrizgavanju c / c v tkiva se molekule insulina lispro v obliki heksamerjev hitro disociirajo v monomere in vstopijo v kri. Drug inzulinski analog - insulin aspart - je nastal z zamenjavo prolina v položaju B28 z negativno nabito asparaginsko kislino. Tako kot insulin lispro se po vbrizganju tudi hitro razgradi v monomere. Pri insulinu glulisin nadomestitev aminokisline asparagin humanega insulina na položaju B3 za lizin in lizin na položaju B29 za glutaminsko kislino prav tako prispeva k hitrejši absorpciji. Ultrachort-delujoče analoge insulina se lahko dajejo neposredno pred obrokom ali po obroku.

Kratkodelujoči insulini (imenovani tudi topni) so raztopine v pufru z nevtralnimi pH vrednostmi (6.6–8.0). Namenjeni so za subkutano, manj pogosto - intramuskularno dajanje. Po potrebi se dajejo tudi intravensko. Imajo hiter in relativno kratek hipoglikemični učinek. Učinek po subkutanem injiciranju se pojavi po 15-20 minutah, doseže maksimum po 2 urah; skupno trajanje delovanja je približno 6 ur, uporabljajo pa se predvsem v bolnišnici med določitvijo odmerka insulina, ki je potreben za bolnika, in tudi kadar je potreben hiter (nujni) učinek - pri diabetični komi in prekomi. Z / v uvodu T_1/2 je 5 minut, zato se pri diabetični ketoacidotični komi insulin daje v / v kapljično. Kratkodelujoči insulinski pripravki se uporabljajo tudi kot anabolična sredstva in so predpisani praviloma v majhnih odmerkih (4-8 ie 1–2 krat dnevno).

Insulini srednje trajanja delovanja so manj topni, počasneje se absorbirajo iz podkožnega tkiva, zaradi česar imajo daljši učinek. Podaljšano delovanje teh zdravil se doseže s prisotnostjo posebnega prolongatorja - protamina (izofan, protapan, bazalnega) ali cinka. Upočasnitev absorpcije insulina v pripravkih, ki vsebujejo suspenzijo insulinske cinkove spojine, zaradi prisotnosti kristalov cinka. NPH-insulin (nevtralni protamin Hagedorn ali izofan) je suspenzija, ki sestoji iz insulina in protamina (protamin je protein, izoliran iz ribjega mleka) v stehiometričnem razmerju.

Dolgotrajno delujoči insulini vključujejo insulin glargin - analog človeškega insulina, pridobljen s tehnologijo rekombinantne DNA - prvo insulinsko zdravilo, ki nima izrazitega vrha delovanja. Insulin glargin dobimo z dvema modifikacijama molekule insulina: zamenjava A-verige (asparagina) z glicinom na položaju 21 in vezava dveh argininskih ostankov na C-konec B-verige. Zdravilo je bistra raztopina s pH 4. Kisli pH stabilizira insulinske heksamerje in zagotavlja dolgo in predvidljivo absorpcijo zdravila iz podkožnega tkiva. Vendar se zaradi kislega pH insulin glargin ne more kombinirati s kratkodelujočimi insulini, ki imajo nevtralni pH. Enkratna injekcija insulina glargin zagotavlja 24-urni nadzor glikemije brez pika. Večina pripravkov insulina ima tako imenovano. "Peak" delovanja, ki se je zabeležila, ko koncentracija insulina v krvi doseže najvišjo vrednost. Insulin glargin nima izrazitega vrha, ker se sprosti v krvni obtok s sorazmerno stalno hitrostjo.

Pripravki insulina s podaljšanim delovanjem so na voljo v različnih dozirnih oblikah, ki imajo hipoglikemični učinek različnega trajanja (od 10 do 36 ur). Podaljšan učinek zmanjša število dnevnih injekcij. Običajno se proizvajajo v obliki suspenzij, ki se dajejo le subkutano ali intramuskularno. Pri diabetični komi in predkomatoznih stanjih se dolgotrajna zdravila ne uporabljajo.

Kombinirani pripravki insulina so suspenzije, ki sestojijo iz nevtralnega topnega kratkodelujočega insulina in insulina-izofana (srednje trajanje delovanja) v določenih razmerjih. Ta kombinacija insulinov različnega trajanja delovanja v enem pripravku omogoča pacientu shranjevanje dveh injekcij z ločeno uporabo zdravil.

Indikacije. Glavna indikacija za uporabo insulina je sladkorna bolezen tipa 1, vendar je pod določenimi pogoji predpisana tudi za sladkorno bolezen tipa 2, vključno z diabetesom mellitusom tipa 2. z odpornostjo proti peroralnim hipoglikemičnim zdravilom, s hudimi sočasnimi boleznimi, pri pripravi na kirurške posege, diabetično komo, s sladkorno boleznijo pri nosečnicah. Kratkodelujoči insulini se uporabljajo ne samo pri sladkorni bolezni, ampak tudi pri nekaterih drugih patoloških procesih, na primer v splošnem izčrpanosti (kot anabolični agent), furunkulozi, tirotoksikozi, pri boleznih želodca (atoni, gastroptozi), kroničnem hepatitisu in primarnih oblikah jetrne ciroze. kot tudi pri nekaterih duševnih boleznih (dajanje velikih odmerkov insulina - tako imenovana hipoglikemična koma); včasih se uporablja kot sestavina »polarizacijskih« raztopin, ki se uporabljajo za zdravljenje akutnega srčnega popuščanja.

Insulin je glavno specifično zdravilo za sladkorno bolezen. Zdravljenje sladkorne bolezni poteka po posebej razvitih shemah z uporabo insulinskih pripravkov različnega trajanja. Izbira zdravila je odvisna od resnosti in značilnosti poteka bolezni, splošnega stanja pacienta in hitrosti nastopa in trajanja delovanja zdravila, ki znižuje sladkor.

Vsi pripravki insulina se uporabljajo ob obvezni skladnosti s prehranskim režimom z omejevanjem energetske vrednosti živil (s 1.700 na 3.000 kcal).

Pri določanju odmerka insulina se ravnajo po ravni glukoze na tešče in podnevi, pa tudi z ravnjo glikozurija podnevi. Končni izbor odmerka se izvaja pod nadzorom zmanjševanja hiperglikemije, glikozurije in splošnega stanja bolnika.

Kontraindikacije. Insulin je kontraindiciran pri boleznih in stanjih, ki se pojavljajo s hipoglikemijo (npr. Insulinom), pri akutnih boleznih jeter, trebušne slinavke, ledvic, razjede želodca in dvanajstnika, z dekompenziranimi srčnimi napakami, akutno koronarno insuficienco in nekaterimi drugimi boleznimi.

Uporaba med nosečnostjo. Glavno zdravilo za zdravljenje sladkorne bolezni med nosečnostjo je zdravljenje z insulinom, ki se izvaja pod strogim nadzorom. V primeru sladkorne bolezni tipa 1 se zdravljenje z insulinom nadaljuje. V primeru diabetesa mellitusa tipa 2 se oralne hipoglikemične droge prekinejo in izvaja se dietna terapija.

Gestacijski diabetes mellitus (noseča sladkorna bolezen) je motnja presnove ogljikovih hidratov, ki se je prvič pojavila med nosečnostjo. Gestacijski diabetes mellitus je povezan s povečanim tveganjem za perinatalno smrtnost, pojavnostjo prirojenih malformacij in tveganjem za napredovanje sladkorne bolezni 5–10 let po porodu. Zdravljenje gestacijskega diabetesa se začne z dieto. Če je prehranska terapija neučinkovita, se uporablja insulin.

Pri bolnikih s predhodno obstoječim ali gestacijskim diabetesom mellitusom je pomembno ohraniti ustrezno uravnavanje presnovnih procesov v celotni nosečnosti. Potreba po insulinu se lahko zmanjša v prvem trimesečju nosečnosti in se poveča v drugem in tretjem trimesečju. Med porodom in takoj za njimi se lahko potreba po insulinu dramatično zmanjša (tveganje za hipoglikemijo se poveča). V teh razmerah je bistveno skrbno spremljanje glukoze v krvi.

Insulin ne prodre skozi placentno pregrado. Vendar pa matična protitelesa IgG proti insulinu prehajajo skozi placento in verjetno povzročajo hiperglikemijo v plodu tako, da nevtralizirajo izločanje insulina iz njega. Po drugi strani lahko neželena disociacija kompleksov insulina - protitelesa povzroči hiperinzulinemijo in hipoglikemijo pri plodu ali novorojenčku. Pokazalo se je, da prehod z govejih / svinjskih insulinov na monokomponentne pripravke spremlja zmanjšanje titra protiteles. V zvezi s tem je med nosečnostjo priporočljivo uporabljati samo pripravke humanega insulina.

Anaboliki insulina (tako kot drugi na novo razviti učinkovini) se predpisujejo previdno med nosečnostjo, čeprav ni zanesljivih dokazov o neželenih učinkih. V skladu s splošno sprejetimi priporočili FDA (Food and Drug Administration), ki določajo možnost uporabe zdravil med nosečnostjo, pripravki insulina za učinek na plod spadajo v kategorijo B (študija o razmnoževanju na živalih ni pokazala škodljivega vpliva na plod ter ustrezne in strogo nadzorovane študije pri nosečnicah). ženske niso bile opravljene) ali v kategorijo C (študije o razmnoževanju pri živalih so pokazale škodljiv učinek na plod in niso bile izvedene ustrezne in dobro kontrolirane študije pri nosečnicah, vendar možne koristi, povezane z uporabo zdravil pri nosečnicah, lahko upravičijo njeno uporabo kljub možnemu tveganju). Torej, insulin lizpro spada v razred B, insulin aspart in insulin glargin pa v razred C.

Zapleti zdravljenja z insulinom. Hipoglikemija. Vnos prevelikih odmerkov in pomanjkanje vnosa ogljikovih hidratov s hrano lahko povzročita neželeno hipoglikemično stanje, hipoglikemična koma se lahko razvije z izgubo zavesti, krči in depresijo srčne aktivnosti. Hipoglikemija se lahko razvije tudi zaradi delovanja dodatnih dejavnikov, ki povečajo občutljivost za insulin (na primer adrenalna insuficienca, hipopituitarizem) ali povečajo absorpcijo glukoze v tkivih (vadba).

Zgodnji simptomi hipoglikemije, ki so v veliki meri povezani z aktivacijo simpatičnega živčnega sistema (adrenergični simptomi), so tahikardija, hladen znoj, tremor, aktivacija parasimpatičnega sistema - huda lakota, slabost in mravljinčenje v ustih in jeziku. Pri prvih znakih hipoglikemije je treba nujno ukrepati: bolnik naj pije sladki čaj ali poje nekaj kock sladkorja. Pri hipoglikemični komi se 40% raztopina glukoze v količini 20–40 ml ali več injicira v veno, dokler bolnik ne zapusti komatnega stanja (običajno ne več kot 100 ml). Hipoglikemijo lahko odstranimo tudi z intramuskularnim ali subkutanim dajanjem glukagona.

Povečanje telesne mase med zdravljenjem z insulinom je povezano z odpravo glukozurija, povečanjem dejanske kalorične vsebnosti hrane, povečanjem apetita in stimulacijo lipogeneze pod delovanjem insulina. Če upoštevate načela prehrane, se lahko temu stranskemu učinku izognemo.

Uporaba sodobnih visoko prečiščenih hormonskih zdravil (zlasti gensko spremenjenih pripravkov humanega insulina) razmeroma redko vodi v razvoj insulinske rezistence in alergij, vendar taki primeri niso izključeni. Razvoj akutne alergijske reakcije zahteva takojšnjo desenzibilizacijo in zamenjavo zdravila. Pri razvijanju reakcije na pripravke govejega / prašičjega insulina jih je treba nadomestiti s pripravki humanega insulina. Lokalne in sistemske reakcije (pruritus, lokalni ali sistemski izpuščaj, nastajanje podkožnih vozlov na mestu injiciranja) so povezane z neustreznim čiščenjem insulina iz nečistoč ali z uporabo govejega ali prašičjega insulina, ki se razlikujejo po aminokislinskih zaporedjih od človeka.

Najpogostejše alergijske reakcije so kožna protitelesa, ki jih posredujejo IgE. Občasno so opažene sistemske alergijske reakcije in odpornost proti insulinu, ki jo posredujejo protitelesa IgG.

Zamegljen vid Prehodne motnje refrakcije na očesu se pojavijo na samem začetku zdravljenja z insulinom in izginejo same po sebi v 2-3 tednih.

Edem. V prvih tednih zdravljenja se po zaostanku tekočine pojavi tudi prehodni edem nog otekanje insulina.

Lokalne reakcije vključujejo lipodistrofijo na mestu ponavljajočih se injekcij (redki zaplet). Dodelite lipoatrofijo (izginotje vnosov podkožnega maščevja) in lipohipertrofijo (povečano odlaganje podkožne maščobe). Ti dve državi imata drugačno naravo. Lipoatrofija - imunološka reakcija, predvsem zaradi uporabe slabo prečiščenih insulinskih pripravkov živalskega izvora, zdaj praktično ni na voljo. Lipohipertrofija se razvije z uporabo visoko prečiščenih pripravkov humanega insulina in se lahko pojavi, če je tehnika injiciranja motena (hladna priprava, alkohol postane pod kožo) in tudi zaradi anaboličnega lokalnega delovanja samega pripravka. Lipohipertrofija ustvari kozmetično napako, ki je problem za bolnike. Poleg tega zaradi te napake absorbira zdravilo. Da bi preprečili razvoj lipohipertrofije, je priporočljivo, da mesta injiciranja nenehno spreminjate na istem območju, tako da med dvema točkama ostane vsaj 1 cm.

Na mestu dajanja so lahko lokalne reakcije, kot je bolečina.

Interakcija Pripravke insulina lahko med seboj kombiniramo. Veliko zdravil lahko povzroči hipo- ali hiperglikemijo ali spremeni reakcijo bolnika s sladkorno boleznijo na zdravljenje. Razmislite o medsebojnem delovanju, ki je možno s sočasno uporabo insulina z drugimi zdravili. Alfa-blokatorji in beta-adrenomimetiki povečajo izločanje endogenega insulina in povečajo učinek zdravila. Hipoglikemični učinek insulina se poveča z oralnimi hipoglikemičnimi sredstvi, salicilati, zaviralci MAO (vključno s furazolidonom, prokarbazinom, selegilinom), zaviralci ACE, bromokriptinom, oktreotidom, sulfanilamidi, anabolnimi steroidi (zlasti oksandrolonom, metandienonom) in s terapevti in terapevti ter s pomočjo terapij in terapij ter sulfidov, anaboličnih steroidov, anaboličnih steroidov glukagona, ki vodi do hipoglikemije, zlasti v primeru odpornosti proti insulinu, boste morda morali zmanjšati odmerek insulina), somatostatin analogi, gvanetidin, dizo piramide, klofibrat, ketokonazol, litijevi preparati, mebendazol, pentamidin, piridoksin, propoksifen, fenilbutazon, fluoksetin, teofilin, fenfluramin, litijevi pripravki, pripravki kalcija, tetraciklini. Klorokin, kinidin, kinin zmanjšajo razgradnjo insulina in lahko povečajo koncentracijo insulina v krvi in ​​povečajo tveganje za hipoglikemijo.

Inhibitorji karboanhidraze (zlasti acetazolamid) s spodbujanjem β-celic trebušne slinavke spodbujajo sproščanje insulina in povečajo občutljivost receptorjev in tkiv na insulin; čeprav lahko sočasna uporaba teh zdravil z insulinom poveča hipoglikemični učinek, je učinek lahko nepredvidljiv.

Številna zdravila povzročajo hiperglikemijo pri zdravih ljudeh in poslabšajo potek bolezni pri bolnikih s sladkorno boleznijo. Hipoglikemični učinek insulina je oslabljen: antiretrovirusna zdravila, asparaginaza, peroralni hormonski kontraceptivi, glukokortikoidi, diuretiki (tiazidi, etakrinska kislina), antagonisti heparina, H₂-receptorji, sulfinpirazon, triciklični antidepresivi, dobutamin, izoniazid, kalcitonin, niacin, simpatikomimetiki, danazol, klonidin, BKK, diazoksid, morfij, fenitoin, somatotropin, ščitnični hormoni, fenotiazinski derivati, ščitnični hormoni, derivati ​​fenotiazina,

Glukokortikoidi in epinefrin imajo nasproten učinek na insulin na perifernih tkivih. Tako lahko dolgotrajno dajanje sistemskih glukokortikoidov povzroči hiperglikemijo, vključno z diabetesom mellitusom (steroidni diabetes), ki se lahko pojavi pri približno 14% bolnikov, ki jemljejo sistemske kortikosteroide več tednov ali z dolgoročno uporabo topikalnih kortikosteroidov. Nekatera zdravila neposredno zavirajo izločanje insulina (fenitoin, klonidin, diltiazem) ali zmanjšajo rezerve kalija (diuretiki). Tiroidni hormoni pospešujejo presnovo insulina.

Najpomembnejši in pogosto vplivajo na delovanje beta-blokatorjev insulina, peroralnih antidiabetikov, glukokortikoidov, etanola, salicilatov.

Etanol zavira glukoneogenezo v jetrih. Ta učinek opazimo pri vseh ljudeh. V zvezi s tem je treba upoštevati, da lahko zloraba alkoholnih pijač v ozadju zdravljenja z insulinom vodi v razvoj hudega hipoglikemičnega stanja. Majhne količine alkohola, ki jih jemljete s hrano, običajno ne povzročajo težav.

Zaviralci adrenergičnih receptorjev beta lahko zavirajo izločanje insulina, spremenijo presnovo ogljikovih hidratov in povečajo periferno odpornost na insulin, kar vodi do hiperglikemije. Lahko pa tudi zavirajo učinek kateholaminov na glukoneogenezo in glikogenolizo, kar je povezano s tveganjem hudih hipoglikemičnih reakcij pri diabetičnih bolnikih. Poleg tega lahko katerikoli beta-adrenergični zaviralec prikrije adrenergične simptome, ki jih povzroča znižanje ravni glukoze v krvi (vključno s tremorjem, palpitacijami), s čimer moti bolnikovo pravočasno prepoznavanje hipoglikemije. Selektivna beta₁-adrenergični blokatorji (vključno z acebutololom, atenololom, betaksololom, bisoprololom, metoprololom) kažejo te učinke v manjši meri.

NSAID in visoki odmerki salicilatov zavirajo sintezo prostaglandina E (ki zavira izločanje endogenega insulina) in tako povečajo bazalno izločanje insulina, povečajo občutljivost β-celic trebušne slinavke na glukozo; hipoglikemični učinek ob sočasni uporabi lahko zahteva prilagoditev odmerka nesteroidnih protivnetnih zdravil ali salicilatov in / ali insulina, zlasti z dolgoročno delitvijo.

Trenutno se proizvaja precejšnje število pripravkov insulina, vključno s pripravki. pridobljene iz pankreasa živali in sintetizirane z genskim inženiringom. Pripravki, ki so izbrani za zdravljenje z insulinom, so gensko spremenjeni visoko prečiščeni humani insulini z minimalno antigenostjo (imunogena aktivnost) in tudi analogi humanega insulina.

Pripravki insulina se proizvajajo v steklenih vialah, hermetično zaprtih z gumijastimi zamaški s tekočim aluminijem, v posebnih tako imenovanih. insulinske brizge ali injekcijske brizge. Pri uporabi injekcijskih peresnikov se pripravki nahajajo v posebnih vložkih za viale (penfill).

Razvijajo se intranazalne oblike insulina in pripravki insulina za peroralno dajanje. Pri kombinaciji insulina z detergentom in dajanjem v obliki aerosola na nosni sluznici se efektivna plazemska koncentracija doseže tako hitro, kot pri dajanju IV bolusa. Razvijajo se intranazalni in peroralni pripravki insulina ali pa se opravljajo klinična preskušanja.