Določanje glukoze z metodo glukoze oksidaze

Analize

Določanje koncentracije glukoze v krvi je ena najpogosteje izvedenih biokemijskih študij v laboratorijih.

Metoda glukozne oksidaze za določanje glukoze v krvi in urinu temelji na reakciji oksidacije glukoze v prisotnosti encima glukoza oksidaze z nastankom vodikovega peroksida, ki v prisotnosti peroksidaze oksidira ortotolidin, da tvori obarvane izdelke; o Koncentracija glukoze je obljubljena s količino barvnih izdelkov.

Ker je metoda glukoza oksidaze namenjena ugotavljanju glukoze in ne vseh vrst sladkorjev, se uporablja pri diferencialni diagnozi naslednjih bolezni:

Načelo metode glukozne oksidaze za določanje glukoze

Glukoza v prisotnosti encima glukoza oksidaze oksidira z atmosferskim kisikom, da nastane vodikov peroksid med reakcijo. Vodikov peroksid v prisotnosti encima peroksidaze oksidira ortotoluidin, da tvori obarvano spojino, katere intenzivnost barve je sorazmerna z vsebnostjo glukoze. Ta metoda vam omogoča določitev ravni glukoze v krvni plazmi, serumu in cerebrospinalni tekočini.

Normalna koncentracija glukoze v krvi, mmol / l

- v plazmi, v natsheartse

novorojenčki - 1,7 - 4,2
otroci od 6 tednov do 15 let - 3,3 - 5,4
odrasli (moški, ženske) - 3,9 - 5,6

- v serumu, v natsheartse

novorojenčki - 2,6 - 4,2
otroci od 6. tedna do 2. leta - 3.3 - 5.4
odrasli (moški, ženske) - 3,9 - 5,6

Potrebni reagenti za določanje glukoze z metodo glukoza-oksidaze

1. Natrijev klorid 9 gramov / liter (izotonična raztopina): pripravljen z raztapljanjem 0,9 g NaCl v 100 ml vode.

2. Cinkov sulfat, 50 g / l: 5 g cinkovega sulfata (ZnS04) raztopimo v vodi, volumen je doveden na 100 ml.

3. Natrijev hidroksid, 0,3 mol / l: pripravljen z raztapljanjem 1,2 g NaOH v 100 ml vode, koncentracija se preveri s titracijo (naj bo 0,3 n).

4. Ortotoluidin, 1% raztopina: 1 g zdravila se raztopi v 100 ml absolutnega alkohola. Raztopino lahko hranimo v hladilniku v bučki s steklenim zamaškom več mesecev. Komercialno dostopen produkt lahko očistimo s prekristalizacijo, za katero raztopimo v absolutnem alkoholu, dodamo vodo in oborjene kristale odsesamo na filtru, nato posušimo nad kalcijevim kloridom.

5. Raztopina acetatnega pufra pH 4,8: 4 dele 0,25 n ocetne kisline (preverite s titracijo) in 6 delov 0,25 n natrijevega acetata (vsebuje 34 g CH3COONa X ZN2O v 1 litru).

6. Glukoza oksidaza je suh pripravek z aktivnostjo 3000 enot / mg ali več.

7. Peroksidaza hrena. 1 mg raztopimo v 5 ml acetatnega pufra, lahko ga shranimo v hladilniku več dni.

8. Delovni reagent: raztopite 2 mg glukoze oksidaze in 1 mg peroksidaze v 80 ml acetatnega pufra, dodajte 1 ml 1% raztopine ortotoluidina, premešajte in s pufrsko raztopino zmešajte prostornino na 100 ml. Delovni reagent mora biti prozoren, brezbarven ali imeti rahlo zelen odtenek, v tem primeru pa je stabilen, ko se hrani na hladnem. Če je barva intenzivna ali po nekaj urah po pripravi, začne oborina padati, to pomeni, da ortotoluidin ni dovolj čist in ga je treba rekristalizirati.

9. Umerjanje raztopin glukoze. Glukozo predhodno sušimo pri 37 ° C in shranimo v eksikatorju. Najprej pripravimo bazično raztopino s koncentracijo 50 mmol / l, za katero raztopimo 180 mg snovi v 20 ml nasičene raztopine (približno 0,3%) benzojske kisline. Iz te raztopine pripravimo delovne raztopine za umerjanje, ki vsebujejo 3; 6; 9; 12; 15; 18 in 21 mmol / l, za katere vzamejo 0,6; 1.2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 in 4,2 ml bazične raztopine in nasičena raztopina benzojske kisline se prenese na volumen 10 ml. Te raztopine vsebujejo glukozo v enakih koncentracijah, kot se pojavljajo v krvi, kar olajša izračune med kalibracijo.

Napredek pri določanju glukoze z metodo glukozne oksidaze

V epruvete za centrifugiranje dodamo 1,1 ml raztopine natrijevega klorida, 0,4 ml raztopine cinkovega sulfata in 0,4 ml 0,3 N raztopine NaOH, premešamo; istočasno se tvori zelo tanek cinkov hidroksidni gel, 0,1 ml krvi ali kalibrirne raztopine se sprosti v vodo, ponovno zmeša in centrifugira po 10 minutah pri hitrosti 3000 rpm 10 minut.

V 1 ml supernatanta dodamo 3 ml delovnega reagenta in rahlo premešamo.

Postopno se začne razvijati barva, ki pri normalni sobni temperaturi doseže maksimum v 13-15 minutah, nato pa se postopoma zmanjša. Fotometrično vedno po istem časovnem obdobju po dodajanju delovnega reagenta v kivete z dolžino optične poti 1 centimeter z rdečim svetlobnim filtrom (valovna dolžina 625 nm) proti prostem teku, ki je nastavljen hkrati z delovnimi vzorci, namesto krvi pa vzemite fiziološko raztopino natrijevega klorida.

Pri pripravi umeritvene krivulje namesto vzorcev krvi vzamemo 0,1 ml ustrezne raztopine za umerjanje.

Izračun glukoze se lahko izvede v skladu s pravilom razmerij ali umeritvenim načrtom, da se določi koncentracija glukoze (mmol / l) na eni osi, vrednost ekstinkcije pa na drugi.

Opombe o metodi določanja glukoze z metodo glukozne oksidaze

1. Najprej lahko spustite kri iz pipete v izotonično raztopino natrijevega klorida in nato dodajte raztopine cinkovega sulfata in NaOH.

2. Pri sistematičnem delu ni potrebno stalno graditi urnika umerjanja za vse točke, zadostuje, da se slepi vzorec in 2-3 točke v razponu od 3 do 9 mmol / l obdelajo dnevno in pripravi celoten urnik kalibracije le pri spreminjanju reagentov ali prilagajanju postopka.

Metoda glukozne oksidaze za določanje glukoze

Metoda glukoza-oksidaze se uporablja za določanje koncentracije glukoze izključno v različnih telesnih tekočinah. Prednost tega testa je njegova natančnost. Diagnostika, v nasprotju s hitrimi metodami, omogoča odkrivanje količine čiste glukoze, brez fruktoze in drugih sladkorjev. Načelo te reakcije je barvanje raztopine, ki nastane zaradi interakcije oksidacijskih sredstev s specifičnimi barvili. Vrednotenje rezultatov raziskav se izvaja z metodo kolorimetrije in primerjavo s standardnimi raztopinami.

Kdaj je predpisana metoda glukozne oksidaze?

Ta test se uporablja za zaznavanje okvarjene tolerance sladkorja in razvoja pre-diabetesa, kot tudi na višino bolezni. Toda analiza se le redko uporablja za takšne namene, to je zaradi visokih stroškov in dolgega čakanja na rezultat. Najpogosteje se določanje glukoze v krvi in urinu s to metodo uporablja pri diferencialni diagnozi bolezni, kot so:

sindrom laktozne intolerance;
intoleranca za fruktozo;
sproščanje fruktoze s telesnimi tekočinami;
povečana koncentracija pentoze v urinu.

Nedvomna prednost testa glukozne oksidaze je njegova natančnost.

Kaj je osnova te metode?

Obstajajo različne metode za določanje koncentracije glukoze v krvi, vendar je glukoza oksidaza najbolj natančna. V bistvu gre za to, da interakcija sladkorja s kisikom v zraku oksidira reagent. V raztopino se sprosti vodikov peroksid. Ta snov vzajemno deluje z ortotoluidinom in tvori obarvano spojino. Za obnašanje te reakcije je potrebna prisotnost posebnih encimov. V oksidacijski reakciji mora biti prisotna glukoza oksidaza, pri barvanju tekočine pa peroksidaza. Intenzivnost barve raztopine bo odvisna od vsebnosti glukoze in bo najbolj intenzivna z visoko vsebnostjo.

Bistvo metode glukozne oksidaze za določanje glukoze

Vrednotenje rezultatov poteka z uporabo kvantitativne metode fotometrije v istem časovnem intervalu. Prepričajte se, da uporabljate umeritveno raztopino, ki vsebuje določeno stopnjo sladkorja in od nje lahko presodite koncentracijo glukoze v telesnih tekočinah, pogosto v krvi.

Kako poteka analiza?

Material vzamemo od bolnika na prazen želodec. Za test uporabite vensko kri v količini 5 ml. Na pragu diagnoze se bolniku pokaže stroga dieta. To bo omogočilo presojo zanesljivosti rezultata in izključilo morebitne napake pri analizi. 2 dni pred odvzemom krvi se mora pacient odreči slabim navadam pitja in kajenja. Prav tako je treba omejiti vnos preveč sladkih jedi in se, če je mogoče, izogniti stresnim situacijam.

Najpogosteje se ta metoda določanja koncentracije glukoze izvaja s postopkom centrifugiranja, ki se uporablja za ločevanje oblikovanih elementov. Količina sladkorja se določi v plazmi. Ko se mu dodajo vsi potrebni reagenti, se barva opazuje po 20 minutah, če se preskus opravi pri sobni temperaturi. Izračun ravni glukoze se izvede v skladu z urnikom umerjanja ali s pravilom delov.

Reagenti za raziskave

Za določitev sladkorja je najbolj primeren za uporabo hitrih metod za določanje glukoze v krvi. To je posledica enostavne uporabe in hitrih rezultatov. Poleg tega bolniku ni treba iti v laboratorij ali bolnišnico. Toda za razliko od testa glukozne oksidaze je takšna diagnoza nezanesljiva. Ker ne razlikuje glukoze od drugih sladkorjev in določa njihovo koncentracijo skupaj.

Osnova za reakcijo glukoze oksidaze je natrijev klorid 9% raztopina in 50% cinkov sulfat. Dodajajo se v fazi centrifugiranja krvi. Poleg tega uporabimo pufersko raztopino z ocetno kislino in natrijevim acetatom. Metoda titracije določa njen pH na 4,8. Nato dodamo glukozno oksidazo, ki povzroči vodikov peroksid in peroksidazo, ki sodeluje pri barvanju raztopine do želene koncentracije, da dobimo natančen rezultat.

Standardi med analizo

Količina sladkorja se meri v posebnih enotah - milimolih na liter raztopine.

Krvne teste glukoze oksidaze je treba opraviti na prazen želodec, za to pa se uporabi plazma ali serum. Stopnja njenega števila za odrasle za ženske in moške je 3,3-5,5. Za otroke, mlajše od 15 let, je ta številka nekoliko nižja in se giblje med 3,2 in 5,3. Pri novorojenčkih je glukoza v krvi 1,7–4,2. Povečanje učinkovitosti opazimo z razvojem bolnika s sladkorno boleznijo ali s kršitvijo tolerance glukoze. To stanje je prediabetes in če ga ne zdravimo pravočasno, bo kmalu povzročilo razvoj te hude patologije.

DELOVNA številka 1. KOLIČINSKA DOLOČITEV GLUKOZE V KRVI. ENZIMATSKA (GLUKOSOOKSIDNA) METODA

Utemeljitev delovanja. Določanje glukoze v polni krvi ali plazmi se opravi pri vsakem bolniku, da se oceni stanje presnove ogljikovih hidratov in diagnosticira patologija (hiperglikemija, hipoglikemija). Za določanje vsebnosti glukoze v krvi se uporablja encimska metoda, ki temelji na oksidaciji glukoze oksidaze v glukonski kislini v prisotnosti kisika. Metoda je zelo specifična za določanje D-glukoze v prisotnosti drugih reducirajočih snovi v ekstraktih tkiva in bioloških tekočinah.

NAČELO METODE. Glukoza oksidaza je kompleksen encim, ki vsebuje FAD kot protetično skupino. Ko se glukoza oksidira z glukozno oksidazo, se dva vodikova atoma ločita od prvega ogljikovega atoma v molekuli glukoze. Poleg tega se ta dva vodikova atoma prenesejo na FAD, nastane FADH₂. Slednji prenaša atome vodika v molekularni kisik in tvori H₂Oh₂. Potem H₂Oh₂ razpade ga encim peroksidaze v vodo in atomski kisik, ki oksidira kromogen (barvilo), ki se ob oksidaciji obarva.

Metoda glukozne oksidaze

Danes so metode, ki temeljijo na uporabi encima glukoza oksidaze, najbolj razširjene. Metoda temelji na naslednji reakciji:

Glukoza oksidaza katalizira prenos dveh vodikovih atomov iz prvega ogljikovega atoma glukoze v kisik, raztopljen v tekočem reagentu. Med reakcijo nastane vodikov peroksid v ekvimolarnih količinah. Tj koncentracija nastalega vodikovega peroksida je enaka določeni koncentraciji glukoze. Zato je uporaba reakcije glukozne oksidaze spremenila problem določanja koncentracije glukoze v problem določanja koncentracije vodikovega peroksida, ki je, kot bo prikazano spodaj, veliko enostavnejša od prve. Tukaj obstaja več metod, ki se danes v laboratorijski praksi pogosto uporabljajo (glej diagram).

Med zgoraj navedenimi metodami registracije je najbolj razširjena fotometrična biokemijska metoda, pri kateri se molekule vodikovega peroksida pod vplivom encima peroksidaze razdelijo v tvorbo aktivne kisikove oblike - superoksidnega anionskega radikala - O₂ -, ki oksidira kromogen, kar vodi do znatne spremembe absorpcijskega spektra kromogena.

Velika priljubljenost te metode za določanje glukoze je zaradi njene visoke specifičnosti in enostavnosti izvajanja. Metodo lahko izvedemo z uporabo običajnega fotometra, kot tudi z uporabo samodejnih biokemičnih avtoanalizatorjev.

Metoda glukozne oksidaze je danes priznana kot ena od najbolj natančnih kvantitativnih metod za določanje glukoze. Kot biološki material se uporablja kot serum in polna kri. Pri delu s slednjim je treba upoštevati dejstvo, da je pri odvzemu kapilarne krvi delež seruma (plazme) odvisen od vrednosti hematokrita, kar lahko negativno vpliva na točnost rezultata. Zato je pri določanju glukoze po zgoraj opisani metodi bolje uporabiti pacientov serum.

Poleg fotometrične metode končne točke so se pred leti pojavili kompleti, v katerih je bila izvedena kinetična fotometrična metoda. Bistvo metode je, da se pri določenem razmerju aktivnosti glukozne oksidaze in peroksidaze hitrost nastajanja obarvane spojine nekaj časa po dodajanju vzorca v delovno raztopino sorazmerno s koncentracijo glukoze v vzorcu. Prednost te metode je, da rezultat ni odvisen od prisotnosti drugih spojin v vzorcu, saj je absorpcija slednjega stabilna skozi čas. Ta metoda zahteva uporabo kinetičnega fotometra, polavtomatskih analizatorjev ali samodejnih biokemičnih analizatorjev. Merjenje koncentracije glukoze iz polne krvi je primerno opraviti z instrumenti, katerih delovanje temelji na amperometričnem principu merjenja z uporabo posebnih encimskih senzorjev. Vodikov peroksid je izjemno nestabilna kemična spojina in lahko služi kot vir nabitih delcev. To se uporablja v encimskih senzorjih membranskega tipa ali v elektrokemičnih elementih prenosnih glukometrov.

V zaključku naj omenimo slabosti metode glukozne oksidaze. Nastali vodikov peroksid in superoksidni anionski ostanki lahko oksidirajo ne samo kromogen, temveč tudi druge snovi, ki so prisotne v biološki tekočini: askorbinska kislina, sečna kislina, bilirubin. Hkrati se zmanjša delež peroksida, ki sodeluje pri oksidaciji kromogena, kar vodi do podcenjevanja rezultata glukoze. Ta metoda je praviloma linearna do 20-30 mmol / l glukoze.

Kvantitativna določitev glukoze v krvi z metodo glukozne oksidaze

Načelo metode. Metoda temelji na specifičnosti delovanja encima glukoza oksidaze. Ta encim oksidira glukozo v prisotnosti molekularnega kisika in tvori glukonolakton, ki spontano hidrolizira v glukonsko kislino. Glukoza oksidaza oksidira glukozo in tvori vodikov peroksid (H₂Oh₂), ki reagira s peroksidazo s 4-aminoantipirinom in fenolom. Rezultat je roza barva spojine, katere optična gostota pri 510 nm je sorazmerna koncentraciji glukoze v vzorcu.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipirin + fenol → kinon imin + 4H₂Oh

Oprema: KFK, centrifuge, termostat, stativi, epruvete, pipete, biološki material, reagenti, ki jih vsebuje delovna raztopina.

preskusni vzorec, ml

standardni vzorec, ml

en preskus (N₂O), ml

Kalibracijska raztopina glukoze (standardna)

Epruvete se 15 minut inkubirajo v termostatu pri 37 ° C, nato se kolorimetrirajo z zelenim filtrom v zelenem filtru v kivetah s debelino plasti 5 mm proti slepi (H)₂O). Roza barva je stabilna 1 uro po inkubaciji.

Izračun vsebnost glukoze, proizvedena s formulo:

C = standard C, kjer

C je vsebnost glukoze v poskusnem vzorcu, mol / l;

Eop je optična gostota vzorca;

Est je optična gostota kalibracijskega vzorca;

S standard - vsebnost v raztopini za umerjanje, mol / l.

Normalne vrednosti:  novorojenčki - 2,8-4,4 mmol / l

 otroci - 3,9 -5,8 mmol / l

 odrasli - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hipoglikemija (HGH). Povečanje glukoze v krvi je posledica številnih razlogov, po katerih sta dve skupini hiperglikemije.

1. Insularno - povezano z nezadostno vsebnostjo insulina v telesu ali zaradi neučinkovitosti njegovega delovanja.

2. Extrainsular (extrainsular) - ni odvisen od učinka insulina.

Naslednji procesi so najpomembnejši pri tvorbi HGH: povečana razgradnja glikogena; povečana neoglukogeneza; inhibicija sinteze glikogena; zmanjšanje izrabe glukoze v tkivih pod vplivom hormonskih antagonistov insulina: somatotropin, glukortikoidi, tiroksin, tirotropin.

Alimentarna hiperglikemija je opažena s pretirano dobavo glukoze v krvi (npr. Hiperglikemija pod obremenitvijo s sladkorjem). "Jetrna" hiperglikemija se pojavi pri difuznih lezijah jeter.

Vztrajna in huda hiperglikemija najpogosteje spremlja sladkorno bolezen. Običajno je izolirati insulin-odvisen diabetes mellitus in diabetes mellitus, neodvisen od insulina, oziroma sladkorno bolezen tipa I in diabetes mellitus tipa II. Nastanek diabetes mellitusa tipa I je povezan predvsem s slabšo sintezo in izmenjavo insulina.

Druga skupina hiperglikemije je povezana predvsem s hiperfunkcijo endokrinih žlez, ki proizvajajo hormone - antagoniste insulina. Opažamo pri boleznih, kot so sindrom in Cushingova bolezen, akromegalija, tirotoksikoza, feokromocitom, glukogenoma. Ravni glukoze v krvi se povečujejo tudi pri nekaterih boleznih jeter (zlasti pri 10-30% bolnikov s cirozo jeter), hemokromatozo (pigmentirana ciroza jeter, bronasta diabetes).

Hipoglikemija (HGP) - znižanje glukoze v krvi - najpogosteje povezano z absolutnim ali relativnim povečanjem ravni insulina v krvi. Vnepankreaticheskim hipoglikemija opazili zaradi neravnovesja med obsegom procesov glikogenolizo in glukoneogenezo v jetrih med akutni in kronični hepatitis, ciroza, akutni in subakutni jetrno boleznijo, zastrupitvi z alkoholom, zastrupitev z arzen, fosfor, med dolgotrajno mehansko zlatenica, kongestivno jeter, primarna ali metastatskega raka jeter. Zmanjšanje koncentracije glukoze v krvi je pogosto opaženo pri bolnikih z rakom na požiralniku in drugih malignih tumorjih lokalizacije zunaj trebušne votline (fibrom, fibrosarkom, nevromo), pa tudi pri neusmiljeni bruhanju, anoreksiji, sladkorni bolezni v jetrih, uremiji, obilno laktaciji in glukozuriji pri nosečnicah.

Hipoglikemija je lahko osrednjega izvora zaradi duševne travme, encefalitisa, subarahnoidne krvavitve, možganskega tumorja.

1. Dedne bolezni prebave ogljikovih hidratov.

2. Katere vrste hiperglukoze so vam znane?

3. Kateri so vzroki za patološko hiperglukozemijo?

4. Kaj je vzrok za sladkorno bolezen, odvisno od insulina?

5. Kateri so biokemični vzroki dednih bolezni: a) glikogenoza? b) aglikogenoza? c) fruktozemijo? d) galaktosemija?

6. Kakšne so biokemične spremembe v presnovi ogljikovih hidratov med postom?

7. Načelo metode določanja tolerance glukoze.

Metode glukozoksidaze in heksokinaze za določanje serumske glukoze v krvi

Natančna diagnoza, predpisovanje zdravljenja zahteva vrsto laboratorijskih testov.

Metoda določanja serumske glukoze je najpomembnejše orodje za odkrivanje hiper- in hipoglikemije pri bolnikih s sladkorno boleznijo.

Metoda omogoča prilagoditev podatkov o presnovnih motnjah v medicinski terapiji. Diagnostične ravni glukoze lahko določimo tudi v polni krvi in njeni plazmi.

Metode za določanje glukoze v krvi

Veliko se je razvilo metodo za določanje količine glukoze v krvi.

Nekateri izmed njih (reduktometrični, kolorimetrični) se praktično ne uporabljajo zaradi visoke toksičnosti in nizke natančnosti rezultatov.

Najpogosteje uporabljene študije encimov. Metoda glukoza-oksidaze je metoda barvne reakcije, ki se pojavi, ko se ogrevajo ogljikovi hidrati. Heksokinaza določa aktivnost krvi na heksokinazi.

Metoda glukozne oksidaze

Metoda glukozne oksidaze za določanje glukoze v krvi temelji na oksidacijski reakciji pod vplivom encima. To tvori vodikov peroksid, obarva snov Chromogen, katere koncentracija določa količino glukoze.

Metoda glukozne oksidaze se uporablja za:

dedna intoleranca za fruktozo;
pentozurii;
laktuloza.

Pomanjkljivost študije je, da je vodikov peroksid sposoben oksidirati tako kromogen kot askorbinsko, sečno kislino in bilirubin v krvi. Izračunamo količino fotometrične metode glukoze, intenziteto barvanja primerjamo z umeritveno krivuljo.

V laboratorijskih pogojih se lahko določi raven snovi:

v venski krvi. Uporabljajo se avtomatski analizatorji;
v kapilarni krvi. Ograjo izvedemo s prstom.

Elektrokemijska metoda je sestavljena iz uporabe elektrod, ki vsebujejo glukozo oksidazo. Določimo količino nastalega vodikovega peroksida ali preostali nivo kisika, porabljenega med oksidacijskim postopkom.

Metoda heksokinaze

Snov je najpomembnejši encim presnove glukoze, ki omejuje hitrost procesa v celicah.

V laboratorijskih pogojih, pod delovanjem heksokinaze, se glukoza fosforilira z adenozin trifosfatom.

Kot rezultat reakcije nastanejo organske molekule, katerih količina je določena s stopnjo absorpcije svetlobe v ultravijoličnem območju. Preveč hitra reakcija na heksokinazo je lahko tudi znak malignih tumorjev.

Priprava na analizo

Preskusi glukoze v krvnem serumu so predpisani za:

Pred analizo morate upoštevati številne pogoje, da bodo rezultati čim bolj zanesljivi:

raziskave potekajo na prazen želodec. Material zjutraj;
nekaj dni pred diagnozo se je treba izogibati težkim fizičnim naporom, stresu;
V dnevni prehrani bolnika mora biti vsaj 150 gramov ogljikovih hidratov. S pomanjkanjem se bo raven glukoze povečala in pade počasi, kar izkrivlja analizo podatkov;
dan pred diagnozo ne sme kaditi in piti alkoholnih pijač;
ni mogoče izvesti raziskav po težkih operacijah, porodu, v prisotnosti vnetij. Kontraindicirana pri analizi jetrne ciroze, poslabšanju bolezni želodca, tumorskih procesih;
nekaj dni pred študijo se ne sme izvajati fizioterapevtskih postopkov, jemati peroralnih kontraceptivov, diuretikov, psihotropnih zdravil, kofeina.

Analiza lahko povzroči lažno pozitivne rezultate pri hipokalemiji in endokrinih boleznih (Cushingov sindrom, tirotoksikoza).

Normativi glukoze v krvnem serumu po starosti

Običajni kazalniki so odvisni od starosti:

lahko popkovnična kri vsebuje od 2,5 do 5,3 mmol / l;
pri nedonošenčkih - od 1,1 do 3 mmol / l;
otroci prvega dneva življenja - od 2,22 do 3,33;
pri starosti od 2,7 do 4,4;
pri otrocih, starejših od 6 let - od 3,3 do 5,5 mmol / l;
pri odraslih do 60 let - od 4,4 do 6,3;
pri starejših - od 4,6 do 6,1 mmol / l.

Hipoglikemija pri odraslih je diagnosticirana z vrednostmi glukoze manj kot 3,3 mmol / l, hiperglikemija pa več kot 6,1 mmol / l.

Metoda glukozne oksidaze za določanje glukoze v plazmi

Veseli smo, da vas lahko pozdravimo na spletni strani www.unimedao.ru!

Hvala, ker ste odgovorili na naše vprašanje.

19.11.2009

Dr. Gerasimenko V.A., Kurilyak O.A.

Iz arhiva časopisa "News A / O Unimed"

Določanje koncentracije glukoze v krvi je ena najpogosteje izvedenih biokemijskih študij v QDL. Razlog za izjemno priljubljenost testa je povezana z visoko pojavnostjo sladkorne bolezni. Ta test se izvaja v bolnišnicah in ambulantah. Bolniki s sladkorno boleznijo so prisiljeni pregledati raven glukoze v krvi doma, ker brez teh informacij težko prilagodijo prehrano, telesno dejavnost, uporabo insulina in drugih antidiabetičnih zdravil. Izjemen pomen preizkusa in velike količine raziskav so spodbudile razvijalce k ustvarjanju različnih vrst pripomočkov in metod za določanje koncentracije glukoze v krvi.

Trenutno obstajajo številne metode za določanje glukoze. Lahko jih razvrstimo na naslednji način.

Metode za določanje glukoze v serumu

- fotometrična končna točka

- reflektivna fotometrija - suha kemija

Prvi dve metodi sta izjemno neprimerni, strupeni in imata nizko natančnost, zato se nanje ne bomo zadrževali.

Metoda glukozne oksidaze

Danes so metode, ki temeljijo na uporabi encima glukoza oksidaze, najbolj razširjene. Metoda temelji na naslednji reakciji:

Na sl. Sliki 1 in 2 prikazujeta spektre delovne raztopine pred in po dodajanju standardne raztopine glukoze. Največja absorpcija reakcijske zmesi - (reagent + glukoza) je v območju 500 nm. V skladu s tem je sprememba optične gostote končne reakcije pri valovni dolžini 480-520 nm sorazmerna koncentraciji glukoze v vzorcu.

Velika priljubljenost te metode za določanje glukoze je zaradi njene visoke specifičnosti in enostavnosti izvajanja. Metodo lahko izvedemo s konvencionalnim fotometrom (boljši od specializiranega biokemičnega fotometra, kot je Mikrolab 540) ali s pomočjo samodejnih biokemičnih avtoanalizatorjev.

Poleg fotometrične metode končne točke so se pred leti pojavili kompleti, v katerih je bila izvedena kinetična fotometrična metoda. Bistvo metode je, da se pri določenem razmerju aktivnosti glukozne oksidaze in peroksidaze hitrost nastajanja obarvane spojine nekaj časa po dodajanju vzorca v delovno raztopino sorazmerno s koncentracijo glukoze v vzorcu. Prednost te metode je, da rezultat ni odvisen od prisotnosti drugih spojin v vzorcu, saj je absorpcija slednjega stabilna skozi čas. Ta metoda zahteva uporabo kinetičnega fotometra, na primer Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, polavtomatskih analizatorjev, kot je Clima 15, ali avtomatskih biokemičnih analizatorjev. Merjenje koncentracije glukoze iz polne krvi je primerno opraviti z instrumenti, katerih delovanje temelji na amperometričnem principu merjenja z uporabo posebnih encimskih senzorjev. Vodikov peroksid je izjemno nestabilna kemična spojina in lahko služi kot vir nabitih delcev. To se uporablja v encimskih senzorjih membranskega tipa ali v elektrokemičnih elementih prenosnih glukometrov.

Vzorec polne krvi (običajno 20 µl) se razredči v sistemski puferski raztopini (rdeče krvne celice se uničijo), nato pa se skozi linijo napeljejo v pretočno celico. Glukoza, podvržena oksidaciji pod vplivom encima glukoza oksidaze, ki se nahaja na membrani. Nastali vodikov peroksid difundira skozi membrano in se nadalje pod oksidacijo v katalitični reakciji pod vplivom platine. Difuzija vodikovega peroksida na površini platine tvori tok, ki je sorazmeren s številom molekul H₂Oh₂. Tako dobljen signal obdeluje naprava pri ustrezni vrednosti napetosti. Ta izmerjena vrednost je sorazmerna koncentraciji glukoze v vzorcu.

Kot primer instrumentov z zgoraj opisano metodo lahko omenimo analizatorje glukoze Biosen (Nemčija). Te naprave so primerne za uporabo ne samo v bolnišnicah, temveč tudi v poliklinikah, kjer se testiranje glukoze izvaja predvsem iz kapilarne krvi.

Pomemben korak v razvoju kliničnih laboratorijskih diagnostičnih metod je bil pojav "suhe kemije". Seveda je bila ena od prvih aplikacij te tehnologije naloga določanja glukoze v krvi pacienta. Prve naprave so bile bistveno slabše od natančnosti tradicionalnih laboratorijskih raziskovalnih metod. Vendar so sčasoma številna podjetja uspela razviti takšne diagnostične trakove in odsevne fotometre, ki so omogočili zelo visoko natančnost analize. Globotometri One Touch in testni trakovi Life Scan (ZDA) so zelo priljubljeni po vsem svetu in uspešno kombinirajo analitično natančnost kvantitativne encimske metode s hitrostjo in enostavnostjo "suhe kemije".

Merilniki glukoze v krvi One Touch so zasnovani za hitro in natančno merjenje ravni glukoze v polni krvi. One Touch testni trak vsebuje vse potrebne kemijske komponente za dvostopenjsko metodo glukozne oksidaze, vključno z encimi glukoza oksidaze in peroksidazo, ki se adsorbirajo na edinstveno porozno hidrofilno membrano. Rezultat reakcije je tvorba obarvanega kompleksa. Intenzivnost razvite barve se zabeleži z reflektirajočim minifotometrom.

Membranski testni trak One Touch spominja na gobo z mikroskopskimi porami in opravlja trojno funkcijo. Deluje: 1) kot rezervoar, zbiranje potrebne količine krvi, 2) kot filter, blokiranje trdnega celičnega materiala (eritrociti, levkociti itd.), 3) kot gladka optična površina, na kateri se meri reflektirana svetloba. Slednja funkcija je zlasti pomembna za delovanje naprave. Omogoča branje spodnjega dela traku, medtem ko kri ostane na zgornjem delu testnega traku. V skladu s tem ni potrebno oprati (pobrisati) krvi s površine testnega traku.

Poleg tega ima membrana hidrofilne lastnosti, zaradi katerih se kapljica krvi "pritegne" na površino testnega traku, ko se dotakne.

Naprava One Touch vključuje dve posebni LED. Obdelava razvite barve na testnem traku je naslednja. Takoj, ko je testni trak vstavljen v napravo, pride do ničelnega odčitavanja. V tem trenutku na zaslonu vidimo: »Čakaj«. Ko na testni trak nanesemo kapljico krvi, se krvna plazma takoj sorbira z membrano, medtem ko eritrociti in presežna plazma ostanejo na površini membrane. Po popolni absorpciji kapljice krvi se takoj pojavi barvanje. Naprava beleži spremembo velikosti odboja in samodejno zažene časovnik. Po 45 sekundah se kemijska reakcija konča, rezultat odboja svetlobe pa se obdela. Barvni reakcijski proizvod absorbira svetlobo, ki jo oddaja prva LED dioda. Tudi krvne celice in odvečna plazma absorbirajo svetlobo, ki jo oddaja dioda. Da bi popravili refleksijo ozadja, se drugo odčitavanje izvede z drugo LED na drugačni valovni dolžini. Razlika med signali prve in druge svetleče diode vsebuje informacije o absorpciji svetlobe s kromogenom. Signal, ki ga prejme kromogen za oceno koncentracije glukoze, je povezan s posebno umeritvijo. Vse naprave One Touch so umerjene z referenčno metodo na laboratorijskem analizatorju glukoze. S tem postopkom dobimo standardno umeritveno krivuljo. Treba je opozoriti, da je zelo težko določiti proizvodnjo testnih trakov, ki bi bili popolnoma kemično enaki zaradi zelo nizke koncentracije reagentov. Za rešitev tega problema se uporablja standardna umeritvena krivulja, ki jo sestavlja 16 kalibracijskih linij. Nadzor kakovosti se opravi takoj po izdelavi testnih lističev, kar omogoča določitev, katere kalibracijske črte (od 1 do 16) lahko uporabimo za ta testni trak. To je tako imenovana kodna številka, ki je pritrjena na embalažo testnega traku. Teh 16 kalibracijskih črt je programiranih tudi v mikroprocesorju instrumenta. Da bi dobili optimalno točne rezultate, se kodna številka, ki je navedena na embalaži testnih lističev, vnese v napravo s tipko za kodo. Tako lahko nepravilno nameščena koda na instrumentu povzroči napako pri merjenju.

Odkar so na trg prišle naprave One Touch, je bilo v laboratorijih Rusije, Amerike in Evrope opravljenih veliko kliničnih študij. Eno takšnih raziskav je opravil Endokrinološki znanstveni center Ruske akademije medicinskih znanosti na zahtevo Ruskega združenja za medicinsko laboratorijsko diagnostiko. Specialisti centra so izvedli primerjalno analizo dveh metod za merjenje ravni glukoze v krvi. Rezultati, pridobljeni na One Touch, so bili primerjani s podatki, pridobljenimi na biokemičnem analizatorju Spectrum II (Abbott Laboratories, ZDA), ki izvaja heksokinazno metodo za določanje glukoze. Pregledanih je bilo 190 krvnih vzorcev 95 bolnikov. Korelacijski koeficient rezultatov je bil 0,98641. Koeficient variacije normalnega in patološkega razpona na merilniku One Touch ne presega 2,5%.

V uradnem poročilu Endokrinološkega raziskovalnega centra Ruske akademije medicinskih znanosti je navedeno: »Naprave One Touch imajo visoko natančnost in natančnost ter široko paleto meritev. Lahko se uporabljajo za diagnosticiranje izrednih razmer pri sladkorni bolezni, vključno z ekipami za nujne primere, ker te naprave niso samo zanesljive, temveč tudi hitro proizvajajo rezultate. "

Metoda heksokinaze

Registracija poteka pri valovni dolžini 340 nm pri absorpciji NADH. Ta metoda je zelo specifična in ne reagira z drugimi sestavinami krvnega seruma. Metoda heksokinaze velja za referenco za določanje glukoze. Praviloma je linearna do 50 mmol / l, kar ji je omogočilo, da se široko priporoča za klinike z endokrinološkimi oddelki.

Od opisanih različnih metod za določanje glukoze se lahko zaposleni v podjetju QDL sami odločijo, katero metodo določanja in katero napravo bodo izbrali:

Metode "mokre" biokemije, ki se izvajajo na samodejnih biokemičnih analizatorjih, bodo zagotavljale potrebe laboratorijev z velikim pretokom analiz.
Analizatorji glukoze tipa Biosen zahtevajo minimalne napore upravljavca, saj so popolnoma avtomatizirani in dovolj produktivni (hitrost od 50 do 200 vzorcev na uro).
Za laboratorije z majhnim številom študij in ekspresnih laboratorijev je primeren specialni biokemijski fotometer Mikrolab 540.
Za pomoč ekipam skrij pomoč je odlična rešitev - merilniki glukoze v krvi, kot je One Touch.

Zato je naloga QDL, da zagotovi ne le hitro, ampak tudi zelo natančno določanje glukoze, danes popolnoma rešljiva.

Glukoza v krvi, urin, liker

Glukoza v krvi je strogo nadzorovana.

Nadzor koncentracije glukoze v krvi izvajajo živčni vplivi in hormoni.

Nervna regulacija

Živčna regulacija koncentracije glukoze v krvi se izraža v pozitivnem učinku n.vagusa na izločanje insulina in zaviralni učinek na ta proces simpatične inervacije. Poleg tega je sproščanje adrenalina v kri podvrženo simpatičnim vplivom.

Hormonska regulacija

Glavni hormonski regulatorni dejavniki so glukagon, adrenalin, glukokortikoidi, somatotropni hormon na eni strani in insulin na drugi strani. Vsi hormoni, razen insulina, ki prizadenejo jetra, povečajo glikemijo.

Inzulin je edini hormon v telesu, ki je namenjen zniževanju ravni glukoze v krvi. S svojim vplivom se glukoza močno absorbira v mišice in maščobno tkivo.

Znižanje koncentracije glukoze v krvi z insulinom se doseže na naslednje načine:

prehod glukoze v celice - aktiviranje transportnih proteinov GluT 4 na citoplazmatski membrani,
vključenost glukoze v glikolizo - povečanje sinteze glukokinaze, encima, imenovanega past glukoze, spodbujanje sinteze drugih ključnih glikoliznih encimov - fosfofruktokranaze, piruvat kinaze,
povečana sinteza glikogena - aktivacija glikogen sintaze in stimulacija njene sinteze, kar olajša pretvorbo odvečne glukoze v glikogen,
aktiviranje poti pentoznega fosfata - indukcija sinteze glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in 6-fosfoglukonat dehidrogenaze,
povečana lipogeneza - vključenost glukoze v sintezo triacilglicerolov ali fosfolipidov.

Mnoga tkiva so popolnoma neobčutljiva na delovanje insulina, imenujejo jih neodvisno od insulina. Med njimi so živčno tkivo, steklasto telo, leča, mrežnica, glomerularne ledvične celice, endotelijske celice, moda in rdeče krvne celice.

Glukagon zviša glukozo v krvi:

povečanje mobilizacije glikogena z aktivacijo glikogen fosforilaze,
spodbujanje glukoneogeneze - povečanje delovanja encimov piruvat karboksilaza, fosfoenolpiruvat karboksikinaze, fruktoza-1,6-difosfataze.

Adrenalin povzroča hiperglikemijo:

aktiviranje mobilizacije glikogena - stimulacija glikogen fosforilaze,

Glukokortikoidi povečajo glukozo v krvi

z zaviranjem prehoda glukoze v celico,
spodbujanje glukoneogeneze - povečanje sinteze encimov piruvat karboksilaza, fosfoenolpiruvat karboksikinaze, fruktoza-1,6-difosfataze.

Tabela povzema glavne vidike hormonskih vplivov:

Aktivacija glikogenolize v jetrih;
Stimulacija glukoneogeneze;

Povečana glukoneogeneza;
Zmanjšana prepustnost membrane do glukoze.

Glukoza v krvi v klinični praksi

Več kot 90% vseh topnih ogljikovih hidratov krvi z nizko molekulsko maso je glukoza; poleg tega so lahko v majhnih količinah prisotne fruktoza, maltoza, manoza in pentoza, v primeru patologije pa galaktoza. Skupaj z njimi v krvi vsebuje polisaharide, povezane z beljakovinami.

Še posebej intenzivno se zaužijejo glukoza, ki se uporablja za različne potrebe tkiva centralnega živčnega sistema, rdečih krvnih celic, medulle ledvic. Pri vmesni presnovi se glukoza uporablja za tvorbo glikogena, glicerola in maščobnih kislin, aminokislin, glukuronske kisline in glikoproteinov. Koncentracija glukoze v krvi je derivat glikolize in oksidacije trikarboksilnih kislin v TCA ciklu, glikogeneza in glikogenoliza v jetrih in mišicah, glukoneogeneza v jetrih in ledvicah ter vnos glukoze iz črevesja.

V klinični praksi se običajno preverijo ravni glukoze v krvi, koncentracija drugih sladkorjev in glikogena se uporablja redkeje. V človeški krvi je glukoza razmeroma enakomerno porazdeljena med plazmo in oblikovanimi elementi, ugotovljeno je bilo, da je vsebnost sladkorja v venski krvi 0,25-1,0 mmol / l (v povprečju 10%) manjša kot pri arterijski in kapilarni krvi. Opredelitev mlečne in piruvične kisline, aktivnost številnih encimov presnove ogljikovih hidratov, sialične in heksuronske kisline, seromucoidi, glikozilirani hemoglobin in drugi indikatorji so znane diagnostične vrednosti.

Vsebnost glukoze v urinu je odvisna od koncentracije v krvi, čeprav se izloča v normalnih in zvišanih koncentracijah krvnega sladkorja. Z zvišanjem koncentracije glukoze v krvi presežemo tako imenovani ledvični prag (pri zdravih ljudeh leži v območju 8,3–9,9 mmol / l) in pride do glukozurije. Pri arteriosklerotičnih ledvicah, ki imajo sladkorno bolezen, zvišanje praga in glukozurija ni mogoče opaziti niti s povečanjem koncentracije glukoze na 11,0-12,1 mmol / l.

Metode za določanje glukoze v krvi

Metode za določanje glukoze v krvi so razdeljene v tri skupine: redukcija, kolorimetrična in encimska.

Metode zmanjševanja (Upoštevati je treba, da metode te skupine dajejo precenjene rezultate (za približno 20-25%), ker kri vsebuje številne spojine, ki niso povezane z ogljikovimi hidrati, vendar imajo redukcijske lastnosti (sečna kislina, glutation, kreatinin, askorbinska kislina). kislino)):
- Hatedorn-Jensenova titrometrična metoda temelji na ponovni vzpostavitvi sladkorja, ko vre v alkalnem mediju, kalijeve soli železa in sina in železovega sludinata. Glede na stopnjo okrevanja je koncentracija sladkorja v krvi raziskana z titrometrijo. Pomembna prednost metode je nizka cena in možnost uporabe v vsakem laboratoriju;
- na osnovi redukcije nitrobenzenov, na primer pikrinske kisline v pikramsko kislino;
- na osnovi sposobnosti glukoze za zmanjšanje bakrovih soli. Nastali monovalentni baker deluje kot intermediat. Oksidira se s kisikom v zraku in obnavlja arzensko-molibdinsko kislino ali fosforno volframsko kislino, ki služi kot končni kromogen.
Kolorimetrične metode. Te vključujejo:
- Somodzhi metoda - redukcijska reakcija bakra, ki je v sestavi bakreno-ortronskega reagenta, na bakrov oksid. Metoda je zahtevna, večstopenjska, nespecifična in se praktično ne uporablja;
- Folin-Wu metoda - redukcija bakrovega tartrata na litijev oksid. Metoda je enostavna, pomanjkljivost pa je pomanjkanje stroge sorazmernosti med intenzivnostjo dobljene barve in koncentracijo glukoze;
- določanje koncentracije glukoze po Morrisu in Roe - dehidracija glukoze pod delovanjem žveplove kisline in njeno preoblikovanje v oksimetilfurfural, ki kondenzira z artronom v modro spojino. Zahteva najčistejše reagente in strogo upoštevanje konstantne reakcijske temperature;
- Gultmanova ortotoluidinska metoda pri modifikaciji Khivarinen-Nikkil, ki je sestavljena iz določanja intenzivnosti barve raztopine, ki se pojavi, ko aromatski amin ortotoluidin medsebojno deluje z aldehidno skupino glukoze v kislem mediju. Ta metoda je natančna in omogoča natančnejšo določitev glukoze.
- Metoda anilina ohranja občutljivost metode orto-toloidina, vendar je še bolj specifična.
Encimske metode:
- na osnovi heksokinazne reakcije. Glukoza pod delovanjem heksokinaze je fosforilirana z ATP, nastali Gl - 6 - F v prisotnosti dehidrogenaze obnavlja NADP. Količina slednjega je določena s povečanjem absorpcije svetlobe v ultravijolični regiji. Metoda je predraga za praktične laboratorije.
- na osnovi oksidacije glukoze v glukuronsko kislino z uporabo encima glukoza oksidaze in tvorbe med reakcijo vodikovega peroksida, ki (v različnih različicah):
  - določena s kemičnimi sredstvi;
  - s sodelovanjem s peroksidazo oksidira brezbarvni ortotolidin in ga v zeleno-modro obarvano spojino, ravnost barvne odvisnosti od koncentracije glukoze ostaja v območju od 1,1 do 22 mmol / l;
  - v prisotnosti fenola s sodelovanjem peroksidaze, oksidira 4-aminoantipirin v barvno obarvano spojino;
  - v prisotnosti bakrovih ionov oksidira fenolftalin v fenolftalein, ki je ob alkalnih pogojih obarvan rdeče.
Elektrokemijske metode, ki uporabljajo elektrode, ki vsebujejo imobilizirane encime, zlasti glukozno oksidazo. Reakcijo zabeležimo s količino nastalega vodikovega peroksida ali z izgubo kisika, porabljenega za oksidacijo glukoze.
Diagnostični trakovi z uporabo reakcije glukoza-oksidaza-peroksidaze in derivati benzidina kot kromogena.

Sprejete so bile tri metode kot enotne: metodo Haggedorn-Jensenove titrometrije, metodo orto-toluidina in metodo o-tolidinske glukozne oksidaze.

Določanje glukoze z metodo ortotoluidina

Načelo

Glukoza pri segrevanju z ortotoludom v prisotnosti žveplove kisline daje modro-zeleno barvo.